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IFNs form a family of multifunctional cytokines notably involved in antiviral defence, cell growth control, apoptosis and modulation of the adaptive immune response. Type –I IFNs, like IFN-α, IFN-β, IFN-ω, and limitin, are produced in response to viral infection. They activate a signal transduction cascade leading to the transcriptional activation of many genes. Most murine IFNs turned out to be N-glycosylated . However, little is known on the influence of N-linked sugars on the activity of these cytokines.
This work aimed to characterize the glycosylation sites of selected murine type-I IFNs and to evaluate the influence of IFN glycosylation on their antiviral and antiproliferative activities. Three IFNs were analyzed: IFN-β which possesses 3 potential N-glycosylation sites, IFN-α13 which possesses 2 potential N-glycosylation sites, and IFN-α6T which is not glycosylated.
We used site-directed mutagenesis to eliminate or to introduce N-glycosylation sites in these molecules. Mutants were then compared to the parental forms to check their glycosylation status and to compare their activities in vitro.
Our data show that the three N-glycosylation sites predicted by the sequence of IFN-β and the two sites predicted by the sequence of IFN-α13 and IFN-α6T, the presence or the absence of sugars had only little influence on their activity in vitro Les IFNs sont une famille de cytokines multifonctionnelles impliquées dans la défense antivirale, dans le contrôle de l’apoptose, dans le contrôle de la croissance cellulaire et dans la modulation de la réponse immunitaire. Les IFNs de type I, comme les IFNs-α, β, ω et la limitine, sont produits en réponse à l’infection virale. Ils exercent leurs actions via des cascades de transduction du signal qui mènent à l’induction de la transcription de nombreux gènes. La plupart des IFNs murins sont N-glycosylés. Cependant, nous ne savons que peu de choses sur l’implication des glycosylations sur l’activité de ces cytokines.
Le but de ce travail était de caractériser les sites N-glycosylation de deux sous-types d’IFNs murins et d’étudier l’influence de cette glycosylation sur l’activité antivirale et antiproliférative de ces IFNs. Les 2 IFNs choisis sont : l’IFN-β dont la séquence comporte 3 sites potentiels de N-glycosylation et l’IFN-α13 dont la séquence en comporte 2. L’IFN-α6T qui ne possède pas de site de N-glycosylation a été étudié comme témoin.
Afin d’identifier les sites réellement glycosylés, nous avons, par mutagénèse dirigée, ajouté ou supprimé 1 ou plusieurs sites de glycosylation à ces IFNs. Nous avons ensuite analysé les mutants produits pour déterminer dans quelle mesure la glycosylation des IFNs influençait leur activité biologique, antivirale ou antiproliférative.
Les résultats obtenus nous montrent que les 3 sites putatifs de l’IFN-β et que les 2 sites putatifs de l’IFN-α13 sont effectivement occupés par des sucres, mais à des degrés divers. L’observation des activités antivirale et antiproliférative nous montre que, pour l’IFN-α13 et l’IFN-α6T, l’ajout ou la suppression de sites de glycosylation n’aurait que peu de conséquences sur leur activité biologique in vitro

Glycosylation --- Interferon-beta --- Interferon-alpha

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Multiple Sclerosis --- Interferon beta-1a

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Immune system --- Lymphocytes --- Respiratory hypersensitivity --- Interferons --- Interferon regulatory factors --- immunology

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Lactate Dehydrogenase-elevating virus (LDV) is a murine artenvirus. The host laboratory has for many years been studying its modulatory effects on the immune microenvironment in mice after LDV infection.Experiments on macrophage activation in mice infected with LDV highlighted its role in aggravating two conditions concomitant to infection but whose origin is independent of it : autoimmune diseases mediated by antibodies directed against blood cells and endotoxin shock.Using the LDV model, it was demonstrated that infection by this virus exacerbates sensitivity to endotoxin shock, a reaction associated with increased production of TNF­ a by activated macrophages and subjected to the action of . bacterial lipopolysaccharide (LPS). Type II interferon (IFN-II) exacerbates the sensitivity to LPS after LDV infection occurs, while IFN-I seem to play a protective role in the development of endotoxin shock, as increased sensitivity to this shock after LDV infection has been observed in miceIFN-I receptor deficient (IFNAR-/- ). This protective effect correlates with theIFN-I regulatory functions in producingIFN- I. In parallel, laboratory researchers have observed increased phagocytosis of opsonised red blood cells and platelets by the macrophages activated after infection with this virus. This effect correlated to increased expression of receptor Ifor the Fe portion of immunoglobulin G (FcyR-I) and FcyR- V. FcyR-III expression also was observed decrease, FcyR-111 being nonetheless a receptor that plays a major role in the increase of erythrophagocytosi s by the macrophages of infected mice. Furthermore, own laboratory found out that thanks toIFN-I, mice are partially protected from anaemia aggravated by infection.In addition,IFN-I seem to partially contrai FcyRs expression.On the basis of IFN-I effects observed on both pathologies targeted in this in vivo model of infection by LDV, own study seeks to identify direct modulatory effects of IFN-I on different murine macrophages functions in an in vitro model .Our first results show a decrease in the expression of the CD14 receptor, not correlated with decreased sensitivity to endotoxin shock, following stimulation withIFN-11 while the expression of the TLR-4 receptor remains unchanged. We don't observe effects of IFN-I on the expression of these receptors on murine peritoneal macrophages. To date, using the ELISA technique, we observe thatI FN-I do not appear to alter TNF-a production by peritoneal macrophages nor by macrophage lineages.In our results,IFN-Iappear to stimulate FcyR-I receptor expression and reduce FcyR-III receptor expression. Moreover,IFN-I do not seem to alter Fcaµ receptor expression. IFN-11, alone or with INF-I, seems to increase expression of FcyR-IV and decrease expression of FcyR-III on peritoneals cells. However, IFN-Iwith IFN-II don't seem to alter FcyR-IV expression.Furthermore, in our RT-qPCR results, we analyse a tendency for FcyR- V and TNF-a RNA messenger expression to increase following stimulation of peritoneal cells by IFN­II. We also observe moderate increase FcyR-I mRNA expression due to theseIFN-I stimulated peritoneal cells. Moreover, FcyR-111 mRNA expression tends to decrease in these IFN-Iand IIstimulated cells. IFN-I seem therefore to produce a stimulatory effect on FcyR-ImRNA expression, which was earlier observed by flow cytometry on the expression of this receptor on peritoneal cells stimulated. Le Lactate Dehydrogenase-elevating Virus (LDV) est un arterivirus murin. Ses effets modulateurs sur le microenvironnement immunitaire chez la souris infectée par celui-ci sont étudiés depuis plusieurs années dans le laboratoire d'accueil.Des expériences portant sur l'activation des macrophages chez des souris infectées par le LDV ont permis de mettre en évidence son rôle dans l'aggravation de deux pathologies concomitantes à l'infection mais dont l'origine est indépendante de celle-ci: les maladies auto- immunes médiées par des anticorps dirigés contre des cellules sanguines et le choc endotoxinique.L'utilisation du modèle LDV a permis d'observer que l'infection par ce virus exacerbe la sensibilité au choc endotoxinique, réaction associée notamment à une augmentation de la production de TNF-a par les macrophages activés et soumis à l'action du lipopolysaccharide bactérien (LPS). De plus, l'interféron de type II (IFN-11) exacerbe la sensibilité au LPS lors de l'infection par LDV tandis que les IFN-I semblent jouer un rôle de protection dans le développement du choc endotoxinique puisque chez les sourisdéficientes pour le récepteur aux IFN-I ( FNAR"1) nous relevons une sensibilité augmentée à ce choc après infection par LDV. Cet effet protecteur est corrélé avec les fonctions de régulation des IFN-I dans la production d'IFN-11.En parallèle, notre laboratoire a pu observer une augmentation de la phagocytose des globules rouges et des plaquettes, tous deux opsonisés par les auto-anticorps, par les macrophages activés suite à l'infection par ce virus. Cet effet corrélé, entre autre, à l'augmentation d'expression des récepteur Ià la portion Fe des immunoglobulines G (FcyR-I) et FcyR-IV.Il a également observé une diminution d'expression de FcyR-III, récepteur qui joue pourtant un rôle majeur dans l'augmentation d'érythrophagocytose par les macrophages de souris infectées. Par ailleurs, le laboratoire a également nt relevé que grâce aux IFN-I, les souris sont partiellement protégées de l'anémie hémolytique auto­ immune aggravée par infection. En outre, les IFN-I semblent contrôler partiellement l'expression des FcyRs.Sur base des effets desIFN-I observés dans les deux pathologies ciblées dans ce modèle in vivo d'infection par le LDV, notre étude a pour but d'identifier des effets modulateurs directs des IFN-I sur différentes fonctions de macrophages murins dans un modèle in vitro.Nos premiers résultats montrent une diminution de l'expression du récepteur CD14, non corrélée à une diminution de la sensibilité au choc endotoxinique, suite à la stimulation par l' FN-II tandis que l'expression du récepteur TLR-4 reste inchangée. Nous n'observons pas d'effet des IFN-I sur l'expression de ces récepteurs sur les macrophages péritonéaux murins. A ce jour, via la technique d'EUSA, nous observons que la présence d'IFN-I ne semble pas modifier la production de TNF-a par des macrophages péritonéaux ni par des lignées de macrophages.Dans nos résultats de cytométrie en flux, les IFN-I semblent stimuler l'expression du récepteur FcyR-Iet diminuer l'expression du récepteur FcyR-III. Par ailleurs, lesI FN-I semblent ne pas modifier l'expression du Fcaµ. L'IFN-11, seul ou combiné aux IFN-1, semble stimuler l'expression du Fey-IV et diminuer celle du FcyR-III. Toutefois, les IFN-1 combinés à l'IFN-II ne semblent pas modifier l'expression du FcyR- V.De plus, nous ana lysons dans nos résultats de RT-qPCR une tendance à l'augmentation d'expression de l'ARN messager codant pour le FcyR-IV et le TNF-a suite à la stimulation des cellules péritonéales par l'IFN-11. Nous observons également une tendance à l'augmentation d'expression de l'ARNm codant pour le FcyR-1 par ces mêmes cellules péritonéales stimulées par les IFN-I, en concordance avec l'analyse de l'expression de ce récepteur sur les cellules péritonéales stimulées aux IFN-1 et II en cytométrie en flux. Par ailleurs, l'expression de l'ARNm codant pour le FcyR-III diminue dans ces mêmes cellules stimulées par les I FN-1 combinés à l' FN-II.

Lactate dehydrogenase-elevating virus --- Antibodies, Monoclonal, Murine-Derived --- Interferon Type I

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Antiviral Agents. --- Interferons. --- Interferon --- Viral Interference --- Antiviral Drugs --- Antivirals --- Agents, Antiviral --- Drugs, Antiviral --- Interferon Inducers --- Virus Diseases --- Viruses --- Virus Inactivation --- Antiviral agents --- Therapeutic use --- Congresses --- Medicine [Industrial ] --- Antiviral --- Antiviral Agent --- Antiviral Drug --- Agent, Antiviral --- Drug, Antiviral --- Antiviral Agents --- Interferons