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Suite à la demande de certains producteurs wallons de beurre au lait cru confrontés à un problème récurrent de contamination de leur produit en E. coli, DiversiFerm a souhaité étudier cette problématique pour mieux la comprendre et pouvoir apporter aux producteurs des conseils afin d’y remédier. L’étude de la contamination en E coli du beurre au lait cru fait l’objet de ce travail. E. coli est une bactérie dont la présence ou non est un indicateur d’hygiène du procédé de fabrication. Les normes énoncées dans le Règlement (CE) n°2073/2005 encadrent le taux de contamination dans les denrées alimentaires afin d’offrir une garantie d’hygiène aux consommateurs. Le processus de fabrication du beurre compte plusieurs étapes : la traite, qui n’entre pas dans le cadre de ce travail, l’écrémage, la maturation, le barattage, le lavage, le malaxage et le conditionnement. L’étude repose sur le suivi de trois cycles de production de beurre au lait cru dans six fermes distinctes confrontées à la présence répétée d’E. coli dans le beurre produit. La méthode de travail pour cette étude a consisté à prélever des échantillons de surfaces (cinq points de prélèvement et trois répétitions) et des produits présents au cours du processus de fabrication du beurre : lait entier, crème, lait écrémé, crème maturée et beurre (cinq répétitions par produit). Ces prélèvements ont eu lieu à différentes étapes du processus de fabrication, à savoir avant et après l’écrémage, après la maturation et après le barattage. La présence et les dénombrements de E. coli ont été réalisés à l’aide de Petrifilms. La contamination mesurée traduit la qualité du nettoyage de l’équipement en ce qui concerne les échantillons de surfaces, et de la qualité microbiologique pour cette bactérie dans les produits laitiers. Selon la classification du règlement européen, sur les 18 lots de beurres échantillonnés et testés dans cette étude, un seul lot était de qualité satisfaisante, trois étaient acceptables et les 14 autres insatisfaisants, soit 78%. Les résultats des prélèvements de surfaces montrent qu’un point critique de contamination est le tuyau d’arrivée du lait entier. Un deuxième point a pu être mis en évidence : l’orifice de passage du lait entier vers l’écrémeuse. La propreté de ces deux points est donc primordiale. Pour ce qui est de la contamination en E. coli dans les produits laitiers, l’étude a essayé d’identifier les facteurs pouvant l’influencer. Une corrélation pour le taux d’E. coli ou de coliformes a pu être établie par régression linéaire entre plusieurs couples de produits. Des tests statistiques ANOVA ont, eux, permis de révéler l’importance de la qualité microbiologique en E. coli du lait entier utilisé, la qualité étant liée dans cette étude au type d’équipement de traite utilisé (salle ou robot de traite) et à la propreté de cet équipement évaluée à la sortie du lactoduc. En effet, dans les exploitations de l’étude utilisant des robots, le lait entier était mis en attente d’être écrémé dans un réservoir tampon pendant plusieurs heures sans refroidissement, permettant ainsi le développement d’E. coli. Des tests GLM ont montré l’impact favorable de l’utilisation de ferments pour la maturation de la crème. Enfin, l’effet du mélange de différents lots de crème maturée pour un même barattage a également pu être mis en évidence dans les résultats. Des pistes de solution ont été émises pour remédier à la contamination en E. coli chez les producteurs de l’étude. Celles-ci pourraient être appliquées à d’autres producteurs confrontés à une problématique semblable. Ces pistes consistent en l’amélioration du nettoyage de l’équipement, la diminution du temps d’attente du lait entier non refroidi avant l’écrémage, et l’ensemencement de la crème avec des ferments lactiques pour la maturation. Des études ultérieures pourront approfondir le sujet et vérifier les hypothèses émises. Following the request of some Walloon raw milk butter producers faced with a recurrent problem of E. coli contamination of their product, DiversiFerm wished to study the issue to understand it better and to be able to provide producers with recommendations to remedy it. The study of Escherichia coli contamination in raw milk butter is the subject of this paper. E. coli is a bacterium whose presence or absence is an indicator of hygiene for the manufacturing process. The standards set out in Regulation (EC) No 2073/2005 govern the level of contamination in food products in order to provide consumers with a guarantee of hygiene. The butter manufacturing process includes several stages: milking, which is outside the scope of this work, skimming, maturation, churning, washing, kneading and packaging. The study relies on the monitoring of three production cycles of raw milk butter on six different farms faced with the repeated presence of E. coli in the resulting butter. The method of work for this study consisted of taking samples of surfaces (five sampling points and three repetitions) and samples of the products present during the butter production process: whole milk, cream, skimmed milk, ripened cream and butter (five repetitions per product). These samples were taken at different stages of the manufacturing process, i.e. before and after skimming, after maturation and after churning. The E. coli in the samples were cultured on Petrifilm on the same day so that they could be enumerated. The level of E. coli measured on the Petrifilms reflects the quality of the cleaning of the equipment for the surface samples and the microbiological quality for this bacterium in the dairy products. Based on the classification of the European Regulation, out of 18 batches of butter sampled and tested in this study, only one batch was of satisfactory quality, three were acceptable and the other 14 unsatisfactory, i.e. 78%. The results of the surface sampling show that a critical point of contamination is the whole milk supply pipe. A second point was found to be the whole milk inlet to the skimmer. The cleanliness of these two points is therefore of paramount importance. As for E. coli contamination in dairy products, the study tried to identify possible contributing factors. A correlation for E. coli or coliform levels could be established by linear regression between several product pairs. Statistical ANOVA tests revealed the importance of the microbiological quality in E. coli of the whole milk used, the quality being linked in this study to the type of milking equipment used (parlour or milking robot) and to the cleanliness of this equipment rated at the outlet of the milk duct. Indeed, on those farms participating in the study which use robots, the whole milk was left to stand in the buffer tank for several hours without cooling before skimming, thus allowing the development of E. coli. GLM tests showed the favorable impact of using ferments for cream maturation. Finally, the effect of mixing different batches of ripened cream for the same churning could also be seen in the results. Suggestions for solutions to the E. coli contamination of the producers in the study were made. These solutions may be applicable to other producers facing a similar problem. The solutions include improving equipment cleaning, reducing the waiting time of uncooled whole milk before skimming, and inoculating the cream with lactic ferments for maturation. Additional studies may further investigate the subject and verify the hypotheses.
Beurre --- Lait cru --- Escherichia coli --- E. coli --- Petrifilm --- Hygiène alimentaire --- Normes microbiologiques --- Butter --- Raw milk --- Escherichia coli --- E. coli --- Petrifilm --- Food safety --- Microbiological standards --- Sciences du vivant > Microbiologie
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Although Escherichia coli is probably one off the best characterized organisms, very little is known about the mechanisms governing the biogenesis of its outer membrane and preserving its integrity during the bacterial cell cycle. For example, we have only a very limited knowledge of the way in which the various components of this membrane, namely phospholipids, lipopolysaccharides and β barrel proteins, are carried across the periplasm and then inserted in the membrane after synthesis in the cytoplasm or in the inner membrane.
My host team focuses on coming to a better understanding of the mechanisms permitting the folding and insertion of β barrel proteins in the outer membrane. In addition to the fundamental interest of studying these mechanisms, this research should lead to the development of new antibiotics that are effective against Gram negative bacteria. Indeed, the physicochemical properties of the outer membrane make these bacteria very resistant to many bacterial agents.
The β barrel proteins of the E. coli cell envelope are synthesized in the cytoplasm, and then carried through the inner membrane as unfolded polypeptides. They must then cross the periplasm before reaching the outer membrane as unfolded polypeptides. They must then cross the periplasm before reaching the outer membrane where they are assembled. According to the current model, β barrel proteins are escorted in the periplasm by chaperones that are present in this compartment. The precise role of these chaperones has however not been characterized.
FkpA is one of the four periplasmic chaperones identified so far. Its structure and in vitro chaperone activity have been well studied. However, we know nothing about FkpA’s in vivo role and about the nature of its substrates. The purpose of my work was therefore to characterize the function of this chaperone in the periplasm and to identify its physiological substrates.
To do this, I used a multidisciplinary approach. First, I carried out microbiological studies to characterize the phenotype of different bacterial strains lacking FkpA. The results of these studies have shown that strains lacking both DegP, the primary periplasmic protease, and FkpA were particularly sensitive to elevated temperatures. I’ve also shown that FkpA interacts with several β barrel proteins when purified from strains lacking one of the chaperones involved in the folding of these proteins. Finally, the in vitro tests that I carried out suggest that FkpA is capable of protecting these β barrel proteins from aggregation, without however participating actively in their folding. Put together, my results suggest that FkpA plays a role in the quality control of secreted proteins. Bien qu’Escherichia coli soit probablement l’un des organismes les mieux caractérisés, les mécanismes permettant la biogenèse de sa membrane externe et le maintien de l’intégrité de celle-ci durant le cycle cellulaire bactérien restent très peu connus. Par exemple, nous n’avons qu’une connaissance très partielle de la façon avec laquelle les différents constituants de cette membrane, à savoir les phospholipides, les lipopolysaccharides et les protéines en tonneau β, sont transportés au travers du périplasme puis insérés au sein de celle-ci après avoir été synthétisés dans le cytoplasme ou au niveau de la membrane interne.
Mon laboratoire d’accueil s’intéresse particulièrement aux mécanismes qui permettent le repliement et l’insertion des protéines en tonneau β dans la membrane externe. Outre l’intérêt fondamental que présente l’étude de ces mécanismes, ces recherches devraient ouvrir la voie au développement de nouveaux antibiotiques efficaces contre les bactéries à Gram négatif. En effet, les propriétés physicochimiques de leur membrane externe les rendent peu perméable à de nombreux bactéricides.
Les protéines en tonneau β de l’enveloppe d’E. coli sont synthétisées dans le cytoplasme, puis transportées sous forme non repliée au travers de la membrane interne. Elles doivent ensuite traverser le périplasme avant de gagner la membrane externe où elles sont assemblées et acquièrent leur conformation native. Selon le modèle actuel, les protéines en tonneau β seraient escortées au travers du périplasme par des chaperonnes présentes dans ce compartiment. Le rôle précis de ces dernières n’a cependant pas été caractérisé.
FkpA est lune des quatre chaperonnes périplasmiques identifiées jusqu’à présent. Sa structure et son activité chaperonne in vitro ont bien été étudiées. Cependant, on ne connaît rien du rôle que FkpA joue in vitro et de la nature de ses substrats. L’objectif de mon mémoire était donc de caractériser la fonction exercée par cette chaperonne au sein du périplasme et d’en identifier les substrats. L’objectif de mon mémoire était donc de caractériser la fonction exercée par cette chaperonne au sein du périplasme et d’en identifier les substrats physiologiques.
Pour ce faire, j’ai utilisé une approche multidisciplinaire. Tout d’abord, j’ai réalisé des études microbiologiques afin de caractériser le phénotype de différentes souches bactériennes dépourvues de FkpA. Les résultats de ces études ont fait apparaître que les souches dépourvues de FkpA et de la principale protéase périplasmique, DegP, étaient particulièrement sensibles à un stress thermique. J’ai aussi montré que FkpA interagit avec plusieurs protéines en tonneau β en purifiant la protéine. Pour finir, les tests in vitro réalisés suggèrent que FkpA est capable de protéger ces protéines en tonneau β de l’agrégation, sans toutefois participer activement à leur repliement. Mis ensemble, mes résultats suggèrent que FkpA joue un rôle dans le « contrôle qualité » des protéines sécrétées
Gram-Negative Bacterial Infections --- Cell Membrane --- Biogenesis --- FkpA protein, E coli --- Escherichia coli Proteins --- Periplasm
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Microbiology --- Molecular Biology --- Bacteria --- Escherichia coli --- Physiology --- -Escherichia coli --- Molecular biology --- Molecular biochemistry --- Molecular biophysics --- Biochemistry --- Biophysics --- Biomolecules --- Systems biology --- E. coli (Bacterium) --- Escherichia --- Germs --- Microbes --- Prokaryotes --- Bacterial physiology --- Bacteria - Physiology
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