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Le bactériophage 2C, phage lytique de Bacilius subtilis, possède un génome constitué d’une molécule d’ADN linéaire double brin d’une taille de 150.000 paires de bases où la thymine est entièrement remplacée par une base anormale : l’hydroxyméthyluracile.
Ce travail vise à étudier le mode de réplication du génome viral. A cette fin, deux voies différentes ont été utilisées : la caractérisation de mutants thermosensibles permettant de sélectionner les mutants de réplication et l’isolement par clonage d’éléments auto réplicatifs viraux.
Des mutants thermosensibles du virus 2C ont été isolés, puis caractérisés par trois techniques différentes :
une méthode fluorimétrique, la biosynthèse d’ADN en présence d’uridine marquée et la biosynthèse d’ADN dans des cellules perméabilisées.
La spectrofluorimétrie a permis de mesurer in vivo la quantité d’ADN présent dans des cellules infectées, en utilisant deux fluorochromes qui ont un comportement différent vis-à-vis des ADN bactériens et viraux en fonction de la composition en base de ceux-ci et de la présence de la base anormale dans le génome viral. Cette méthode a permis de regrouper les mutants du phage 2C en trois grandes familles d’après les fonctions qui seraient affectées :
- synthèse ou incorporation de la base anormale
- réplication de l’ADN viral
- absence d’inhibition de la synthèse de l’ADN bactérien ou réplication ralentie de l’ADN viral.
Pour quelques mutants caractéristiques de chaque famille ainsi définie, nous avons mesuré la biosynthèse de l’ADN viral en présence d’uridine marqué au tritium, dans une souche déficiente dans le système de réparation de l’ADN (rec E4) de B. subtilis, après perturbation du système réplicatif bactérien par les rayons ultra-violets. Cette méthode regroupe les mutants en deux classes :
1. synthèse normale de l’ADN viral
2. réplication ralentie.
Ces données permettent de supposer que le virus 2C peut utiliser certaines fonctions bactériennes pour assurer la réplication de son génome.
La caractérisation par ultracentrifugation isopycnique et par hybridation de l’ADN synthétisé dans des cellules infectées rendues perméables a permis de confirmer les fonctions affectées pour quelques mutants. L’un de ceux-ci serait affecté dans l’inhibition de la synthèse de l’ADN bactérien, un autre dans la biosynthèse de la base anormale ou dans son incorporation dans l’ADN viral.
En utilisant la technique de clonage, nous avons permis à un plasmide (pCM3) ne se répliquant pas initialement dans B. subtilis, de se répliquer dans cet hôte grâce à l’insertion d’un fragment d’ADN provenant du virus 2C. Ceci laisserait supposer que ‘l’origine de réplication virale peut-être reconnue par le système réplicatif bactérien et que l’initiation de la réplication du génome viral peut se dérouler en absence de la base anormale

Bacteriophages --- Replica Techniques --- Bacillus subtilis --- Cloning, Molecular

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Yersinia entercolitica est un agent de gastroenteritis rencontré assez fréquemment chez l’homme. Différents facteurs de virulence ont été identifiés chez cette bactérie. Parmi ceux-ci, certains sont codés par le chromosome : l’entérotoxine Yst, les fimbriae Myf, les internalines Inv et Ail, ainsi que la capacité de capter le fer ; tandis que d’autres sont codés par un plasmide de 70kb, appelé pYVe : la dépendance vis-à-vis des ions Ca[2+], la protéine YadA, les protéines Yops et la lipoprotéine YlpA. L’expression de ces fonctions de virulence est régulée par la protéine de type histone YmoA et/ou par la température et/ou par les ions Ca[2+].
Le fait que les gènes yst et myf soient uniquement transcrits durant la pahse tardive de croissance rendait intéressante l’idée d’étudier le facteur de régulation impliqué dans ce phénomène. Un des candidats potentiel était la protéine RopS, qui est un facteur σ de l’ARN polymérase, déjà décrit chez d’autres entérobactéries. Ce dernier contrôle l’expression de tout un régulon permettant à la bactérie d’acquérir une certaine résistance vis-à-vis de diverses agressions durant la phase stationnaire de croissance.
Ce travail a permis d’identifier un homologue de rpoS chez Y. enterocolitica et de cloner ce dernier à partir du chromosome.
Le gène rpoS de Y. enterocolitica a également été séquencé. Il possède une taille de 993pb et il code une protéine similaire aux autres facteurs σ, particulièrement aux facteurs RpoS identifiés chez d’autres entérobactéries. Les deux gènes entourant rpoS ont été identifiés. Le gène en amont de rpoS est similaire au gène nlpD d’E. coli qui code une lipoprotéine impliquée dans la survie de la bactérie durant la phase stationnaire. Le gène en aval de rpoS est similaire au gène mutS d’E. coli qui code une protéine corrigeant les désappariements au niveau de l’ADN.
Nous avons aussi construit un mutant Y. enterocolitica rpoS par échange allélique afin d’étudier l’influence de RpoS sur l’expression de différents facteurs de virulence. Il s’est avéré que l’expression des deux gènes exprimés durant la phase tardive, yst et myf, était significativement réduite. Ce résultats semble donc suggérer l’intervention du facteur RpoS dans la régulation de l’expression de ces gènes.
Enfin, nous avons tenté de complémenter cette mutation en apportant en trans la protéine RpoS de Y. enterocolitica. Malheureusement, nous n’avons pas réussi à restaurer la production de Yst à un taux identique à celui observé chez la souche sauvage de Y. enterocolitica. La cause de cet échec est discutée plus en détail dans le présent travail.

Yersinia enterocolitica --- Cloning, Molecular --- Sequence Analysis --- Medical Laboratory Science

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To understand why anti-tumoral vaccination leads to tumor regressions in only a minority of patients, we wish to be able to study cytokine gene expression in single T cells from cancer patients.
Therefore, we set up a reliable technique to analyze single cells at the transcriptionnal level. It includes micro-aspiration of individual cells, cDNA synthesis, and quantitative PCR carried out with the genetic material from a single cell, without any preliminary amplification. Setting up this methodology with clonal populations of CD4+ and CD8+ T cells stimulated with PMA-ionomycin, we observed strong intercellular heterogeneity in cytokine gene transcription. Analyzing this heterogeneity, we found out that the main explanation, which cannot be demonstrated rigorously, is differences in the kinetics of activation of individual cells.
We then applied our method to the ex vivo analysis of single blood T cells from patients. We observed an important difference in the proportions of IFNg-producing CD8+ T cells : all anti-EBV CD8+ cells from one donor transcribed the IFNg gene, whereas only 12,5% of anti-MAGE-3.A1 CD8+ cells from a melanoma patient did so. The latter cells are quite rare in blood, and our method is so far the only possibility to analyze them. We will pursue our work by trying to understand the reason for this apparent « anergy » of anti-tumoral T cells Afin de comprendre pourquoi la vaccination anti-tumorale mène à la régression de la tumeur chez une minorité de patients, nous avons voulu étudier les profils d'expression de gènes codant des cytokines dans des lymphocytes T individuels provenant de patients atteints de cancer.
Pour ce faire, nous avons dû mettre au point une technique fiable d'analyse transcriptionnelle de cellules individuelles. Celle-ci comprend l'aspiration des cellules une à une, la synthèse d’ADNc, et les PCR quantitatives réalisées à partir du matériel génétique d'une seule cellule, sans amplification préalable. Lors de ces différentes mises au point, qui ont été réalisées sur des populations clonales de lymphocytes T CD4+ et CD8+ stimulés avec un mélange PMA-ionomycine, nous avons observé une forte diversité intercellulaire au niveau de la transcription des gènes codant des cytokines. Nous l'avons alors étudiée. L'explication majeure de cette diversité, qui ne peut en fait être formellement démontrée, est qu'il existe des cinétiques d'activation différentes d’une cellule à une autre.
Nous avons ensuite, grâce à la même méthode, analysé ex vivo des lymphocytes T individuels provenant de patients et nous avons observé une importante différence dans les profils d'expression d'IFNg parmi les cellules en produisant. Tous les lymphocytes T CD8+ anti-viraux provenant d'un donneur transcrivent le gène codant l’IFNg alors que seulement 12,5% des lymphocytes T CD8+ anti-tumoraux provenant d'un patient atteint de mélanome le font. Ces derniers sont très rares dans le sang de ces patients et notre méthode est pratiquement la seule possibilité pour les analyser. Nous souhaitons poursuivre nos recherches afin de comprendre la raison de cette apparente « anergie » des lymphocytes T anti-tumoraux

T-Lymphocytes --- melanoma-specific antigens --- T-Lymphocytes, Cytotoxic --- Cloning, Molecular

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La maladie d’Alzheimer est une démence dégénérative caractérisée par des pertes neuronales et des lésions cérébrales telles que les dégénérescences neurofibrillaires et les plaques séniles. Au centre des plaques séniles se dépose une substance amyloïde dont le composant majeur est un peptide de 4,2 Kd : le peptide A4. Il dérive de différents précurseurs qui ressemblent à des protéines transmembranaires. Certains de ces précurseurs contiennent un domaine extracellulaire de séquence homologue aux inhibiteurs de protéases à sérine.
Les ADNc correspondants à différents précurseurs du peptide amyloïde ont été cloné dans un vecteur quoi contient l’origine de réplication du virus SV40 : le plasmide pKCR3. Dans un premier temps, des cellules COS ont été transfectées en utilisant les ADNc clonés associés au DEAE-Dextran. 48 heures après la transfection, un anticorps monoclonal détecte les différents précurseurs du peptide amyloïde dans les cellules et leur milieu de culture. Lorsque ces précurseurs contiennent une séquence homologue aux inhibiteurs de protéases à sérine, ils sont capables d’inhiber la trypsine.
Dans le but d’obtenir des transfectants stables exprimant les différents précurseurs du peptide amyloïde, des cellules CHO ont été transfectées en utilisant un précipité de phosphate de calcium contenant à la fois les ADNs clonés et un vecteur possédant un gène de résistance à la Néomycine : le plasmide pSV2Néo. Après une sélection des transfectants stables, par addition au milieu de culture de G418, l’expression des différents précurseurs du peptide amyloïde a été analysée dans les cellules et leur milieu de culture. Les cellules transfectées ont ensuite été soumises à des dilutions limites afin d’obtenir des lignées cellulaires clonales exprimant, tout comme dans le cas des transfectants transitoires, des protéines qui en fonction de leur séquence sont capables d’inhiber la trypsine.
Après transfection du précurseur transmembranaire du peptide amyloïde, la protéine est détectée dans le milieu de culture des cellules transfectées. Cette protéine soluble résulte du clivage du précurseur transmembranaire. Des données récentes de la littérature semblent indiquer que ce clivage serait perturbé chez les patients atteints de la maladie d’Alzheimer. Le marquage métabolique des cellules transfectées à l’aide de méthionine S35 et l’immunoprécipitation des formes solubles du précurseur du peptide amyloïde va nous permettre d’étudier l’influence de différentes protéases et inhibiteurs de protéases sur le cinétique de clivage du précurseur du peptide amyloïde.

Alzheimer Disease --- Amyloid beta-Protein Precursor --- Cloning, Molecular --- Medical Laboratory Science

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De nombreux mélanomes humains expriment des antigènes qui sont reconnus in vitro par des lymphocytes T cytolytiques (CTL) du patient dont provient la tumeur. Récemment, le laboratoire a cloné le gène MAGE-1 codant pour l’antigène de rejet MZ2-E présenté par la molécule HLA-A1 du complexe majeur d’histocompatibilité à la surface des cellules du mélanome MZ2-MEL. Cet antigène MZ2-E est exprimé par des tumeurs de différents types histologiques mais en aucun cas par des cellules normales analysées.
Le clonage du gène MAGE-1 a fait naitre de nouvelles possibilités pour une immunothérapie spécifique de patients cancéreux d’haplotype HLA-A1. Dans le but d’optimaliser l’immunisation de ces patients par des cellules irradiées exprimant l’antigène MZ2-E, nous avons tenté d’obtenir par manipulations génétiques un clone cellulaire très immunogénique.
Nous avons cloné le cDNA du gène MAGE-1dans le vecteur d’expression pcDSRα. Ce vecteur recombinant a été transfecté dans la lignée cellulaire MZ2-MEL.2.2 immunosélectionné pour la perte d’expression de l’antigène E. Pour détecter dans la population cellulaire transfectée les cellules exprimant fortement l’antigène E, nous avons utilisé une méthode basée sur la capacité de ces cellules à stimuler la production du facteur de nécrose tumorale (TNF) par un clone CTL anti-E. Nous avons pu restaurer l’expression de l’antigène E par transfection et générer ainsi des clones dont le niveau d’expression de l’antigène n’est que très légèrement supérieur à celui de la lignée tumorale initiale.
Nous avons voulu étudier si le nombre de molécules HLA-A1 n’est pas un facteur limitant l’expression de l’antigène E. Pour cela, un des clones de transfectants exprimant cet antigène a été transfecté par le gène HLA-A1 cloné dans le vecteur d’expression pcDSRα. Par la même méthode que celle utilisée lors de la transfection du gène MAGE-1, nous n’avons pas observé d’augmentation significative de l’expression de l’antigène E.
Ces résultats peuvent en partie être expliqué par le fait que nous n’avons pas pu mettre en évidence par des réactions de polymérisation en chaîne (PCR) une augmentation significative du niveau de transcription des gènes MAGE-1 et HLA-A1transfectés.

T-Lymphocytes, Cytotoxic --- Cloning, Molecular --- Gene Transfer --- Genetic Vectors --- Medical Laboratory Science