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Nitl is a protein that belongs to the family of Nitrilases that still has a mysterious physiological function. However, Nitl has a close homologue whose function is well known, the ro-amidase Nit2 with which it shares 37% identity and that hydrolyzes a-ketoglutarate in a-ketoglutaramate and ammonia. lt is therefore likely that Nit l acts on a substrate that is structurally similar to that of Nit2. However, there is no other a-ketoglutaryl compound that is a well-known intermediate in the metabolic pathways that are described. This observation led us to consider the question of the physiological function of Nit l assuming it could be an enzyme involved in the metabolism of "abnormal metabolites". Nit l could for example "repair" errors made by enzymes that catalyse reactions using substrates that are structurally related to a-ketoglutarate. A first potential candidate for one of these enzymes is a mitochondrial protein that activates glutarate or succinate to glutarylCoA or succinylCoA, and which could also use the a-ketoglutarate, abundant in the rnitochondria, to form the a-ketoglutarylCoA. Nit l could then hydrolyse this compound, preventing its accumulation on the one hand and, on the other hand allowing the recovery of a-ketoglutarate and CoASH. The CoA transferase that catalyzes this reaction has never been molecularly identified, but there is a metabolic deficiency, the glutaric aciduria type III, that is characterised by an accumulation of glutaric acid in urine, that was linked to homozygous mutations in the gene C70RFJ O. It is therefore likely that C70RFJ O encodes the succinylCoA: glutarate CoA transferase. We expressed the recombinant C70RF10 in Escherichia coli, purified it and showed that, indeed, it activates glutarate or succinate to glutarylCoA or succinylCoA, respectively. We also studied the effect of the Arg336Trp replacement that was described in individuals with glutaric aciduria type III, by showing that it drastically reduced the production of an active recombinant enzyme. Subsequently, we analysed in detail the specificity of the transfer of CoASH and showed that C70RF l 0 can use many dicarboxylic acids as CoASH acceptors, and in particular that a­ ketoglutarate was also activated to a-ketoglutarylCoA.This allowed us to show that a-ketoglutarylCoA was indeed a substrate of Nit l, and that among all dicarboxylylCoAs that are made by C70RF 10, it is the only one that is hydrolyzed by Nit l. However, a-ketoglutarylCoA is not only a substrate for Nit l but also for Nit2, despite a rate of hydrolysis, which is 1.5 times, lower than for Nit l. This observation indicates that a-ketoglutarylCoA is not the physiological substrate of Nitl, but shows undeniably that the presence of a ketone derivative on the a-carbon of the dicarboxylyls compounds that we tested is essential for substrate recognition.Thus, we also explored the possibility that glutamate cysteine ligase, the first enzyme of the glutathione synthesis pathway, which catalyzes the condensation reaction between the y-carbon of glutamate and a­ amine of cysteine, may catalyse by mistake a similar reaction using a-ketoglutarate. ln this case, the a-ketoglutarylcysteine formed could be a substrate for Nit l. However, our experiments showed that a-ketoglutarylcysteine was neither hydrolysed by Nit l nor by Nit2. The detailed analysis of the structures of the catalytic sites of Nit l and Nit2 that we made shows that they are similar, but that Nit l could accommodate a larger substrate molecule than Nit2. Furthermore, our experiments have shown that the subcellular localization of Nit l and Nit2 are similar and appear to be both in the cytoplasm and in the mitochondria. The hypothesis that follows and that should be tested is that Nitl intervenes in the degradation of cyclic a-ketoglutaramate, which is the most abundant form, white Nit2 hydrolyses the linear molecule. This could be done by means of an activation of the cycle via the transfer of a nucleotydyl group by a yet unknown enzyme.The derivative thus formed could then be the potential substrate of Nitl.

nitrilase --- Glutaryl-CoA Dehydrogenase

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Introduction. Les plaquettes contrôlent l'hémostase en adhérant à l'endothélium en cas de lésion et en s'agrégeant. Les mécanismes mis en œuvre dans ce processus physiologique sont similaires à ceux responsables de la thrombose artérielle, une complication grave de l'athérosclérose qui peut mener à un infarctus du myocarde potentiellement mortel. Des données obtenues au laboratoire ont montré qu'une phosphorylation élevée et soutenue de l'acétyl-CoA carboxylase (ACC) est observée dans les plaquettes de patients souffrant d'une maladie coronaire athéromateuse. L'isoforme ACC1, majoritaire dans les plaquettes, est une enzyme clé de la lipogenèse qui peut être régulée par des modifications post­ traductionnelles. Sa phosphorylation inhibe son activité. Hypothèse. Étant donné l'importance du rôle joué par de nombreux lipides dans les plaquettes tant au niveau de substrats énergétiques que de molécules de signalisation, nous postulons qu'une modulation de la phosphorylation/activité de l'ACC pourrait altérer les fonctions plaquettaires (adhésion, activation, agrégation, rétraction du clou plaquettaire et activité pro-coagulante) et/ou le métabolisme énergétique, et par conséquent affecter la formation ou la stabilité d'un thrombus. Méthodes. Dans ce travail, nous avons utilisé un inhibiteur pharmacologique de l'ACC, le TOFA. Des plaquettes humaines ont été pré-incubées en présence de TOFA 30µM pendant 2 heures puis stimulées avec de la thrombine. Nous avons mesuré la lipogenèse via l'incorporation de 14C-acide acétique dans les lipides. Les fonctions plaquettaires ont été mesurées par agrégométrie, cytométrie de flux et microscopie. L'expression et la phosphorylation de certains médiateurs de signalisation ont été examinées par western blot. Le métabolisme des plaquettes a été évalué via la mesure de la consommation d'oxygène. Résultats. Nos résultats montrent que le TOFA diminue la lipogenèse dans les plaquettes. Cette diminution est associée à une altération de la morphologie, à une inhibition de la sécrétion des granules denses et de l'agrégation plaquettaire induites par la thrombine tandis que l'activation du récepteur a.IIbJ33 et la sécrétion des granules a ne sont pas affectés, suggérant que le défaut d'agrégation provient d'une diminution des effets autocrines et paracrines de l'ADP et de l'ATP. Nous montrons que les mécanismes impliqués dans la diminution de la sécrétion des granules denses font intervenir les PKC, notamment la PKCδ, et leurs substrats, la cytohésine-2 et la PKD. De plus, nos résultats suggèrent qu'une diminution du contenu en phosphatidylsérine pourrait contribuer, en partie, à l'inhibition des PKC. À côté de son impact majeur sur la signalisation des plaquettes, le TOFA affecte aussi leur métabolisme énergétique en diminuant la capacité de réserve respiratoire et la respiration mitochondriale liée à la production d'ATP. Conclusion. Notre étude démontre qu’une inhibition soutenue de l’ACC diminue la lipogenèse et affecte la sécrétion des granules denses et l’agrégation via un ou plusieurs mécanismes dépendant des PKC et du métabolisme énergétique. Nous pensons que cela pourrait affecter la stabilité du thrombus chez les patients athéromateux. Introduction: Platelets adhere to the endothelium of vessels when there is a breach and lead to the formation of a clot. By this phenomenon, platelets control hemostasis. Mechanisms involved in this physiological process are similar to those responsible for arterial thrombosis that is a severe complication of atherosclerosis. This disease can lead to myocardial infarction and death. Acetyl-CoA carboxylase (ACC) regulates fatty acids synthesis and oxidation. Previous results from the lab showed that ACC is phosphorylated in platelets from patients with coronary artery disease, potentially due to persistent thrombin generation. ACC phosphorylation results in its inhibition. Aims: Given the primary roles of lipids in platelets structure, energy storage and signaling, we hypothesized that a sustained inhibition of ACC could have consequences on platelets activation and bioenergetics. Methods: To test our hypothesis, platelets were treated with 30µM TOFA, an ACC inhibitor, for 2 hours before thrombin stimulation. We measured lipogenesis via l4C-acetate incorporation into fatty acids. Platelet functions were assessed by aggregometry and flow cytometric studies. Signaling mediators were evaluated by western blot and platelet mitochondrial function was reflected by the oxygen consumption rate. Results: We show that a pre incubation of platelets with TOFA significantly decreased lipogenesis (Control: 6 pmol/min/10 9 platelets ± 0.8; TOFA: 1 pmol/min/10 9 platelets ± 0.3; P<0.05). This effect was accompanied by a significant defect in dense granules secretion and aggregation in response to Iow thrombin concentrations, whereas u-granules secretion was not affected, suggesting that the default in aggregation likely resulted from a lower autocrine and paracrine role of ADP. PKC activity is essential for granule secretion. Accordingly, we show that TOFA significantly decreased PKC substrates phosphorylation in baseline and after thrombin stimulation. Since PKCδ has been shown to play a role in dense granules regulation, the effects of TOFA on its activity was evaluated through the analysis of VASP phosphorylation. Indeed, inhibition of PKCδ has been shown to promote hyper phosphorylation of its Serl57 in platelets. Treatment with TOFA led to a drastic increase of Serl57 phosphorylation, in baseline and after thrombin stimulation, and in a cAMP-independent way. In addition, TOFA treatment significantly decreased phosphorylation of cytohesin-2 and PKD, two PKC substrates playing a critical role in dense granules secretion. Platelet metabolism was also affected by a sustained ACC inhibition, as shown by the TOFA-induced decrease in reserve capacity and ATP-linked respiration. Conclusion: Our study shows that a sustained inhibition of platelet ACC decreases lipogenesis and affects (i) dense granule secretion and aggregation through a PKC/ PKCδ - dependent mechanism, and (ii) platelet bioenergetics. We believe that it could affect thrombus stabilization in atherosclerotic patients.

Acetyl-CoA Carboxylase --- Platelet Function Tests

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To assess the impact of the use of statins during the pre-operative period on the prognosis of the apparition of distant metastases, locoregional recidivism, and the global survival of patients undergoing thoracic surgery for a non-small cell lung cancer, stage I or II, with clean resection margins mirco- and macroscopically. Also, to assess the other peri-operative and clinical factors influencing these patient's prognosis. A retrospective study was conducted on 326 patients treated in the university clinics of Saint Luc between December 1993 and December 2004.13 patients received a treatment by statins during the pre-operative period, or 3,99 % of the sample. 313 patients didn't receive a treatment by statins during the pre-operative period, or 96,01%. The statistic tests were fully realized by the program STATISTICA (data analysis software system) 7th version (Statsoft Inc. 2004, Tulsa). A descriptive study was conducted via the Student t test, and the significative p-value values were verified by the exact Fisher test. A univariate analysis was conducted following the Cox regression model for the three types of prognosis. The survival whithout distant metastases apparition and the global survival with or whithout the use of statins during he pre-operative period, were analyzed by the Kaplan-Meier method. Finally, a multivariate analysis with Cox regression model was conduced for the prognosis of the apparition of distance metastasis and the global survival. The analysis shows a higher pre-operative inflammatory status in the patients having received a treatment by statins during the pre-operative period, The inflammation is also higher for these patients during the first and second post-operative day. The patients having been treated by statins during that period. None of the analysis conducted showed an involvement of the treatment by statins on the prognosis of apparition of distant metastasis, locoregional recidivism, and on the global survival. The results of this study don't show any significative involvement on patient's prognosis by the treatment of statins during the pre-operative period. However, the studied groups weren't fairly balanced. For a next study, the cohort of studied patients will have to be chosen according to the period during which the surgical intervention happened and the data collected regarding the use of statins must be on a national level. Évaluation de l'impact de l'utilisation de statines lors de la période pré-opératoire sur le pronostic d'apparition de métastases à distance, de récidive locorégionale, et de survie globale chezdes patients bénéficiant d'une chirurgie thoracique dans le cadre d'un cancer pulmonaire non à petites cellules primaire, de stade l ou Il, avec marges de résection saines micro - et macroscopiquement. Evaluation des autres facteurs peri-operatoires et cliniques influençant le pronostic de ces patients.Méthodes : Une étude rétrospective a été réalisée sur 326 patients pris en charge aux cliniques universitaires Saint Luc entre décembre 1993 et décembre 2004. 13 d'entre eux ont reçu un traitement par statines lors de la période pré-opératoire, soit 3,99% de l'échantillon. 313 patients n'ont pas reçu de traitement par statines lors de la période pré-opératoire, soit 96,01%.Les tests statistiques ont intégralement été réalisés par le programme STATISTICA (data analysis software system) 7e version (Statsoft Inc. 2004, Tulsa, OK).Une étude descriptive a été réalisée selon le test de Student, et les valeurs de p-value significatives ont été vérifiées par le test exact de Fisher. Une étude univariée a été réalisée suivant le modèle de régression de Cox pour les trois types de pronostics. La survie sans apparition de métastases à distance ainsi que la survie globale selon la prise ou non de statines lors de la période pré-opératoire ont été analysées par la méthode de Kaplan-Meier. Enfin, une étude multivariée selon le modèle de Cox a été réalisée pour le pronostic d'apparition de métastases à distance et pour la survie globale.Résultats : L'analyse met en évidence un statut inflammatoire pré-opératoire plus élevé chez les patients ayant reçu un traitement par statines lors de la période pré-opératoire. L'inflammation est également plus élevée pour ces patients le premier jour post-opératoire et le deuxième jour post­ opératoire. Les patients traités par statines durant la période pré-opératoire sont plus âgés que les patients n'ayant pas reçu de traitement par statines lors de cette période. Aucune des analyses effectuées ne met en évidence une implication de la prise des statines sur le pronostic d'apparition de métastases à distance, de récidive locorégionale, et de survie globale.Discussion : Les résultats de cette étude ne montrent aucune implication significative sur le pronostic du traitement par statines lors de la période pré-opératoire. Cependant, les groupes étudiés n'étaient pas équitablement balancés. Pour une prochaine étude, la cohorte de patients étudiés devra être choisie en fonction de la période durant laquelle a eu lieu l'intervention chirurgicale et des données récoltées concernant l'utilisation de statines au niveau national.

Hydroxymethylglutaryl-CoA Reductase Inhibitors --- Pulmonary Surgical Procedures --- Lung Neoplasms

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Chronic postoperative pain is an important clinical issue, which can have a big impact on the quality of life of operated patients. Neuropathic pain – i.e. pain associated with an injury or a disease of the somatosensory nervous system – are the most disabling, which is why the following paper will focus on that kind of pain. As statins possess anti-inflammatory properties, a link between neuropathic pain and the statin intake can be established. Indeed statins reduce the expression and function of pro inflammatory cytokines, inhibit macrophage migration and decrease the expression of Toll-like receptors (located on glial cells) during a nerve injury. An effect of statins in prevention of chronic postoperative pain might thus be hypothesized. Studies show a certain degree of evidence in animals but this remains to be demonstrated in humans. Many studies have to be carried out with the human population, starting with a retrospective study followed by a prospective randomized controlled trial. However they are difficult to implement and require a huge amount of time. If upcoming trials succeed in demonstrating that statins are able to prevent chronic postoperative pain it would considerably improve the quality of life for the patients and also significantly decrease the cost for the society. Les douleurs chroniques postopératoires sont un problème clinique important et peuvent avoir des répercussions importantes en termes de qualité de vie. Les douleurs neuropathiques, c'est-à-dire des douleurs liées à une lésion ou une maladie du système nerveux somato-sensoriel sont les plus invalidantes. C'est pourquoi ce mémoire se focalise sur ce type de douleurs.Grâce aux propriétés anti-inflammatoires des statines, des liens ont pu être établis entre ces douleurs neuropathiques postopératoires et la prise de statines. En effet, les statines peuvent principalement réduire l 'expression et la fonction des cytokines libérées, inhiber la migration des macrophages et diminuerl'expression des Toll-like récepteurs situés sur les cellules gliales lors d 'une lésion nerveuse. Une hypothèse sur l'effet des statines en prévention des douleurs chroniques postopératoires peut être émise. Des études montrent un certain degré d'évidence chez les animaux mais ceci reste encore à démontrer chez l'humain.De nombreuses études doivent être mises en œuvre chez l'humain, en commençant par une étude rétrospective suivie d 'une étude prospective randomisée contrôlée. Elles sont, cependant, difficiles à mettre en place et demandent un temps considérable.Si les futures études arrivent à démontrer que ces statines peuvent prévenir les douleurs chroniques postopératoires, la qualité de vie des patients en serait fortement améliorée et les coûts pour la société nettement diminués.

Hydroxymethylglutaryl-CoA Reductase Inhibitors --- Chronic Pain --- Postoperative Complications