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RNA --- Analysis --- Ribonucleic acid --- Ribose nucleic acid --- Nucleic acids --- Ribose

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‘Glycation’ is a spontaneous reaction in which sugars react with amines to form Schiff’s bases, which spontaneously rearrange into Amadori products, called fructosamines when the initial reacting sugar was glucose. Fructosamines can be remobed from proteins by a ‘déglycation’ process initiated by fructosamine 3-kinase. The fructosamine 3-phosphates that this enzyme forms are unstable, spontaneously decomposing into 3-desoxyglucosone; inorganic phosphate and the initial amine. Recently an enzyme homologous to fructosamine 3-kinase was identified in mammalian tissues and shown to act with high affinity, not on fructosamines but on ribumosamines. These are potentially formed from ribose, a more powerful ‘glycating’ agent than glucose.
Determining ribose concentration in different tissues is important to assess its ‘glycation potential’ in vivo. As the information was not available, we decided to develop an enzymatic assay for ribose based on its phosphorylation by ribokinase.
Ribokinase assays in different tissues revealed that this enzyme is most active in liver. A purification protocol based on an initial heating step followed by anion exchange chromatography allowed us to purify the enzyme partially, though in insufficient amount for our purpose.
We therefore decided to over-express human ribokinase in E. coli. The cDNA coding a protein sharing 35 % identity with E. coli ribokinase was amplified by PCR and ligated into two vectors allowing the expression of the native form and a his-tagged form of this enzyme. The second form was produced in sufficient amounts and purified by affinity chromatography. A km of 31 μM for ribose and 82 μM for desoxyribose were determined for purified ribokinase. As this enzyme is not specific for ribose we developed two distinct ribose assays: one based on the formation of ADP and the other on the reduction of ribose 5-phosphate; only the latter is specific for ribose.
Using the two assays we determined ribose concentration in perchloric extracts of different rat organs and human blood. Surprisingly, the concentration of this sugar was highest in liver, in spite of the important ribokinase activity. The ribose assayed under these conditions could, however, result from acid hydrolysis of intracellular components due to perchloric acid extraction. If this is the case, the true ribose levels must be extremely low in vivo and glycation by the pentose, insignificant La glycation est un processus spontané dans lequel les sucres réagissent avec des amines pour former dans un premier temps une base de Schiff, qui subit ensuite un réarrangement d’Amadori. Le produit ainsi formé s’appelle fructosamine lorsque le sucre réagissant initialement est le glucose. On sait depuis peu que les fructosamines peuvent être enlevées des protéines par un processus de ‘déglycation’ amorcé par la fructosamine-3-kinase. Les fructosamines-3-phosphates que celle-ci forme sont instables, se décomposent en 3-désoxyglucosone et phosphate inorganique avec régénération de l’amine initiale. Des résultats récents du laboratoire indiquent qu’une seconde enzyme, proche de la fructosamine-3-kinase, est inactive sur les fructosamines, mais catalyse avec une haute affinité la phosphorylation de ribulosamines. Ces dernières peuvent en principe se former à partir de ribose, qui est à peu près 20 fois plus puissant que le glucose comme agent ‘glyquant’.
Pour évaluer le rôle du ribose dans le glycation in vivo, il faudrait connaître la concentration de ribose dans les différents tissus. Cette information n’étant pas disponible, nous avons décidé de mettre au point un dosage enzymatique du ribose basé sur la phosphorylation par la ribokinase. Cette enzyme n’étant pas disponible commercialement, nous avons décidé de la purifier.
Des mesures d’activité dans différents tissus de rat ont indiqué que le foie est l’organe dans lequel la ribokinase est la plus active. Nous avons mis au point un protocole de purification de cette enzyme basé une étape thermique et sur une chromatographie sur échangeurs d’anions. Cependant, la quantité de ribokinase purifiée obtenue est trop faible pour être exploitable dans les différents dosages que nous voulions faire.
Nous avons alors décidé de surexprimer la ribokinase humaine chez E. coli. La séquence de cette enzyme n’ayant pas été identifiée par PCR à partir d’ADNc de foie humain une séquence nucléotidique codant une protéine présentant 35 % d’identité avec la ribokinase d’Escherichia coli. Nous l’avons introduite dans des vecteurs permettant d’exprimer chez E. Coli la protéine soit telle quelle, soit munie d’une étiquette polyhistidine. Des mesures d’activité dans des extraits bactériens et l’analyse de ceux-ci par SDS-PAGE indiquaient que c’était la seconde forme qui était la mieux exprimée.
Cette forme de ribokinase munie d’une étiquette polyhistidine a alors été produite en quantité importante et purifiée par chromatographie d’affinité par les ions Co2+. La protéine purifiée phosphorylait le ribose et le désoxyribose avec des Km de 31 μM et de 82 μM respectivement et des Vmax similaires. La ribokinase n’étant pas spécifique du ribose, nous avons mis au point deux méthodes de dosage, basées respectivement sur la formation d’ADP et celle de ribose-5-phosphate.
A l’aide de ces deux méthodes de dosage, nous avons déterminé la concentration de ribose dans des extraits perchloriques réalisés à partir de différents organes de rat ainsi que de sang humain. Etonnement, le foie présente la concentration la plus élevée en ribose (120 nmol/g) malgré une activité ribokinase importante. Il se pourrait qu’il s’agisse essentiellement de ribose formé par hydrolyse acide de composés intracellulaires lors de l’extraction des tissus en milieu acide.
Si tel est le cas, la glycation in vivo par le ribose doit être extrêmement faible

Ribose --- Fructosamine --- Escherichia coli --- Phosphotransferases --- ribokinase

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MicroRNAs (miRNAs) are RNA molecules, conserved by evolution, that regulate gene expressions and their discovery has revolutionised both basic biomedical research and drug discovery. Expression levels of MiRNAs have been found to vary between tissues and with developmental stages and hence evaluation of the global expression of miRNAs potentially provides opportunities to identify regulatory points for many different biological processes. This wide-ranging 2007 reference work, written by leading experts from both academia and industry, will be an invaluable resource for all those wishing to use miRNA techniques in their own research, from graduate students, post-docs and researchers in academia to those working in R&D in biotechnology and pharmaceutical companies who need to understand this emerging technology. From the discovery of miRNAs and their functions to their detection and role in disease biology, this volume uniquely integrates the basic science with industry application towards drug validation, diagnostic and therapeutic development.

RNA. --- Nucleic acids. --- Polynucleotides --- Biomolecules --- Ribonucleic acid --- Ribose nucleic acid --- Nucleic acids --- Ribose

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Les cellules de la lignée tumorale MZ2-MEL portent plusieurs antigènes reconnus par des lymphocytes T cytotiques autologues. Deux de ces antigènes sont codés par des gènes appelés GAGE. Six messagers GAGE distincts avaient été isolés d’une banque d’ADNc de la lignée MZ2-MEL. Nous possédions également la séquence d’un gène GAGE cloné dans le phage LamdaGEM-11.
la première partie de ce travail a été consacrée à déterminer l’origine des différents messager sen établissant s’ils étaient issus de la transcription d’un seul gène ou de plusieurs gènes appartement à une famille. En criblant une bibliothèque d’ADNc avec une sonde GAGE, nous avons isolé deux nouveaux messages de séquence inédite. Nous avons également isolé 5 cosmides indépendants en criblant une banque d’ADN génomique avec une sonde GAGE. Deux gènes GAGE distincts clonés dans deux de ces cosmides ont été caractérisés. Ils sont transcrits chacun pour donner l’un des deux nouveaux messagers isolés. L’hypothèse de l’existence d’une famille de gènes est confrontée par l’hybridation d’un Southern blot d’ADN génomique avec une sonde GAGE. La diversité des bandes indique qu’il existe une famille de gènes conservés.
La conservation des gènes GAGE au cours de l’évolution a été examinée en hybridant un Southern blot d’ADN génomique de différentes espèces avec une sonde GAGE. A l’exception du singe, aucun signal n’a été observé, ce qui indique que les gènes GAGE sont très peu conservés, même chez les mammifères.
La dernière partie de ce travail a été consacrée à l’étude de l’expression des gènes GAGE. Nous avons cloné un fragment de 1012 pb de la région 5’ d’un gène GAGE dans un plasmide contenant le gène rapporteur de la luciférase et nous l’avons transfecté dans différentes lignées tumorales exprimant ou n’exprimant pas les gènes GAGE. Les résultats indiquent que l’activité transcriptionnelle du promoteur AGE est environ deux fois plus élevée dans les lignées qui expriment les gènes GAGE que dans les lignées qui ne les expriment pas. Nous avons terminé ce travail par une analyse de la méthylation des régions promotrices des gènes GAGE en hybridant un Southern blot d’ADN de différentes lignées tumorales digéré par MspI ou HpaII. Nous avons observé une corrélation entre la déméthylation des sites HpaII situés dans la région promotrice et l’expression des gènes GAGE

Antigen, Neoplasm --- ADP Ribose Transferases --- Medical Laboratory Science

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This MIE volume provides laboratory techniques that aim to predict the structure of a protein which can have tremendous implications ranging from drug design, to cellular pathways and their dynamics, to viral entry into cells.Expert researchers introduce the most advanced technologies and techniques in protein structure and foldingIncludes techniques on tiling assays.

Proteins -- Analysis. --- Proteins -- Conformation. --- Proteins -- Structure. --- RNA. --- Proteins --- Conformation. --- Analysis. --- Ribonucleic acid --- Ribose nucleic acid --- Protein conformation --- Nucleic acids --- Ribose