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Les recherches qui sont à la base de ce mémoire s’inscrivent dans le cadre d’un programme d’étude des antigènes présents sur les protéines des virus de l’immunodéficience humaine.
A mon arrivée dans le laboratoire, des anticorps (Ac) monoclonaux dirigés contre la protéine majeure de la capside du VIH-1 avaient déjà permis l’isolement d’un nombre de clones E. coli exprimant des fragments de la P25 sous forme d’une protéine recombinante. Au cours de ce travail, de nouvelles colonies ont été sélectionnées et l’ensemble a finalement permis de couvrir toute la séquence de cette protéine.
Il m’a alors été possible d’utiliser les colonies et les épitopes ainsi définis pour analyser la réponse humorale (Ac) de sujets infectés par le VIH.
Comme l’indique le titre de ce mémoire, le projet était de décomposer les Ac polyclonaux des sérums en fonction des sites antigéniques et si possible, des épitopes qu’ils reconnaissaient.
La difficulté que posait cette étude est celle du « bruit de fond » : dans le système d’expression utilisé, la protéine P25 est produite dans E. coli ; or tous les sérums reconnaissaient des protéines de cette bactérie, le problème est donc de différencier les clones n’exprimant que des protéines d’E. coli.
Dans une première étape, une méthode d’absorption a dû être mise au point.
Ensuite, pour mieux standardiser le procédé et éliminer une partie des protéines d’E. coli, une purification des protéines recombinantes a été réalisée.
Enfin, pour permettre la détection des Ac dirigés contre un épitope donné, nous avons utilisé une technique basée sur l’inhibition de l’attachement de l’Ac monoclonal spécifique.
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Le but de ce travail consistait à déterminer s’il existait des similarités au niveau génomique, entre de nouvelles particules virales dénommées « X », découvertes dans des cultures cellulaires infectées par le HIV et des sondes provenant de clonage de rétrovirus appartenant à des groupes différents. Ces comparaisons ont été expérimentalement réalisées par des expériences d’hybridation entre les clones marqués radioactivement et des ARN extraits à partir de cultures cellulaires du « X ».
On a pu observer des résultats positifs avec eux de ces clones : le Feline Leukemia virus (FeLV) qui est un rétrovirus responsable d’immunodéficience chez le chat et le Radiation Leukemia virus (RAD LV) qui est un virus leucémique à tropisme thymique dans des cellules de souris soumises à des radiations ionisantes.
Nous avons alors fractionné ces deux clones en fragments qui ont à leur tour, été hybridés avec de l’ARN de « X » afin de préciser quelles étaient les fractions de ces clones qui présentaient des similitudes avec le nouveau génome.
ces expériences nous ont permis de conclure à une origine rétrovirale des particules virales « X » et de confirmer l’appartenance des virus « X » au groupe « MLV related virus » dont font aussi partie les 2 clones précédemment décrits.
Des expériences d’hybridation entre les deux clones ont également confirmé des homologies entre certaines de leurs portions génomiques.
Nous avons également hybridé les mêmes fragments chez les 2 clones avec des sondes d’ADNc issues de l’amplification d’ARN purifiés à partir de cultures cellulaires du « X ».
L’observation d’une hybridation entre l’une de ces sondes d’ADNc et certains fragments des clones et la comparaison des séquences de ces hybrides ont apporté la confirmation de l’origine rétrovirale de cet ADNc, et la détermination de sa séquence qui correspond à une région du « LTR » (Long Terminal Repeat : séquence caractéristiques des rétrovirus et présente aux 2 extrémités du génome).
Retroviridae --- Nucleic Acid Hybridization --- In situ Hybridization --- Medical Laboratory Science
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