Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

In 1966 werd de eerste familie met het hypotonie cystinurie syndroom (HCS) beschreven. HCS is een autosomaal recessieve aandoening, gekenmerkt door neonatale hypotonie, voedingsproblemen, groeihormoondeficiëntie, subtiele faciale kenmerken en cystinurie type I. In de loop der jaren werden 12 bijkomende families met vergelijkbare symptomen geïdentificeerd. De kennis dat cystinurie type I wordt veroorzaakt door mutaties in SLC3A1 heeft de opheldering van het genetisch defect dat aan de basis ligt van HCS enorm versneld. Analyse van de SLC3A1 locus toonde aan dat alle HCS patiënten deleties vertoonden. In totaal werden er in 13 HCS families 5 verschillende deleties gevonden, die in grootte variëren van 24 tot 127 kb. Vier deleties (A-D) hebben gemeenschappelijk dat ze enkel de coderende sequentie van SLC3A1 en PREPL onderbreken. Daarenboven bleek de expressie van de flankerende genen PPM1B en C2orf34 normaal in EBV getransformeerde lymfocyten. Hieruit werd geconcludeerd dat HCS enkel wordt veroorzaakt door de deletie van SLC3A1 en PREPL . Een laatste deletie (E) die werd gevonden onderbreekt niet enkel de coderende regio van SLC3A1 en PREPL , maar ook die van C2orf34 , het gen grenzend aan PREPL . Haplo-insufficiëntie van C2orf34 zorgt echter niet voor een ernstiger fenotype in de patiënt die deze deletie draagt. In 13 HCS families en 1 cystinurie type I familie, werden deleties D en E slechts eenmaal gedetecteerd, terwijl deleties A (6), B (17) en C (2) verschillende malen werden teruggevonden. Het meermaals voorkomen van deleties A, B en C kan ten dele verklaard worden door een ‘founder’ effect. De families afkomstig uit België en Frankrijk tonen duidelijk en geconserveerd haplotype voor de merkers die de deleties flankeren. In de HCS families afkomstig uit Nederland, Italië en de VS, bleek het historisch haplotype niet geconserveerd. Dit kan enerzijds verklaard worden door het feit dat het om een oude deletie gaat waarbij de conservering verloren is gegaan door genetische recombinatie. Anderzijds kunnen we niet uitsluiten dat er een genetisch mechanisme is dat deleties in deze regio promoot. Het is dan wel opmerkelijk dat we exact dezelfde breekpunten terugvinden. De frequentie van deleties A en B in een gerandomiseerde Belgische populatie werd geschat op 3/1000 tot 1,3/10000. Tot slot werd er gezocht naar patiënten met een geïsoleerde PREPL deficiëntie. We mogen verwachten dat deze patiënten alle HCS symptomen met uitzondering van cystinurie type I vertonen. Door de grote gelijkenissen in fenotype werden Prader-Willi syndroom (PWS)-achtige patiënten, waarbij PWS genetisch werd uitgesloten, geselecteerd als kandidaten. In de 34 geselecteerde PWS-achtige patiënten werden echter geen pathogene variaties gevonden. Vermits de deletie van SLC3A1 enkel leidt tot cystinuria type I, wordt aangenomen dat de overige aspecten van het fenotype te wijten zijn aan de functionele inactivatie van PREPL. Het PREPL gen komt breed tot expressie, waarbij de hoogte expressie terug te vinden is in de hersenen, de skeletspieren, de nieren en het hart. Een complex splicing patroon is aanwezig in de 5’ onvertaalde regio. Dit leidt tot 2 proteïnevarianten, PREPLS (638 aminozuren) en PREPLL (727 aminozuren). Beide varianten zijn identiek, met uitzondering van de 89 bijkomende aminozuren aan de aminoterminus van PREPLL. Zowel PREPLS als PREPLL zijn gelokaliseerd in het cytoplasma. PREPL is homoloog aan PREP en OpdB, twee serine oligopeptidasen met een voorkeur voor proline en een basisch residu, respectievelijk. Een gelijkende secundaire structuur wordt voorspeld, waarbij de katalytische residuen geconserveerd zijn op topologisch equivalente plaatsen. We dienen echter op te merken dat er opvallende verschillen zijn in beide termini. Desalniettemin stellen we dat PREPL een nieuw lid is van de prolyl oligopeptidase familie (clan SC, familie S9a). Het eerste experimentele bewijs dat PREPL een actief enzym is werd bekomen door gebruik te maken van een activiteitsgebaseerde probe, FP-biotine. Zowel PREPLS als PREPLL reageren met de probe, wat impliceert dat het katalytisch mechanisme intact en functioneel is. Bovendien wordt geen reactie waargenomen wanneer de katalytische residuen worden gemuteerd naar een alanine residu. Tot slot wordt de FP-biotine reactie geïnhibeerd door typische serine protease inhibitoren. Vervolgens werd de focus gelegd op het vinden van een substraat voor PREPL. Initieel werden kandidaat substraten getest, gebaseerd op het fenotype van HCS patiënten en gebaseerd op de homologie met PREP en OpdB. Vervolgens werden 3 gerandomiseerde technieken aangewend om proteolytische activiteit aan te tonen: de PepChip peptide array, een gerandomiseerde fluorogene P1 substraat bank en tot slot een volledig gedegenereerde peptidenbank. Geen van de experimenten toonde een hydrolyse veroorzaakt door PREPL, hoewel substraten wel werden gekliefd na incubatie met een geschikt controle protease. Als laatste benadering om een substraat te vinden werd een peptidyl a-aminoalkyl fosfonaatdiester bank gescreend. Fosfonaten die in staat bleken om de FP-rhodamine reactie met meer dan 60% te inhiberen zullen als model gebruikt worden voor de synthese van fluorogene substraten. Tot slot hebben we de opvallende verschillen in de homologie tussen PREPL en OpdB onderzocht. Hierbij hebben we aangetoond dat een alanine in plaats van een glycine op de –2 positie van de katalytische serine, een unieke eigenschap van PREPL, de activiteit niet beïnvloedt. Bovendien toonden we aan dat het carboxyterminale deel van het katalytisch domein in PREPL op zichzelf actief is, onafhankelijk van de aminoterminus. Dit in tegenstelling tot zowel PREP als OpdB, waarbij de aminoterminus absoluut noodzakelijk is voor een actieve conformatie. Inzicht in deze unieke structurele eigenschappen van PREPL vormen mogelijk de basis voor het identificeren van een substraat In 1966, the first family with HCS was described. HCS is an autosomal recessive disorder characterised by neonatal hypotonia, feeding difficulties which results in failure to thrive, growth hormone deficiency, minor facial dysmorphic features and cystinuria type I. Over the years, 12 additional families with similar symptoms have been identified. The knowledge that cystinuria type I is caused by mutations in SLC3A1 accelerated the delineation of the genetic defect underlying HCS. Analysing the SLC3A1 locus in HCS patient revealed the presence of different deletions. In total, 5 different deletion were found in 13 HCS families. Their sizes range from 24 to 127 kb. Four deletions (A-D) have in common that only the coding sequences of SLC3A1 and PREPL are disrupted. Expression of the flanking genes PPM1B and C2orf34 was normal in EBV transformed lymphocytes. This led to the conclusion that HCS is caused by the deletions of SLC3A1 and PREPL . One deletion (E) not only disrupts the coding region of SLC3A1 and PREPL , but also of C2orf34 , the gene adjacent to PREPL. Haplo-insufficiency of C2orf34 , however, is not affecting the phenotype in the patient carrying this deletion. In 13 HCS families and 1 cystinuria type I patient, deletion D and E were only found once, while deletion A, B and C were found 6, 17 and 2 times, respectively. The presence for multiple alleles of deletion A, B and C could, at least partially, be explained by a founder effect. The families living in Belgium and France clearly showed a conserved ancestral haplotype for these deletions. However, in HCS families living in The Netherlands, Italy and the USA the ancestral haplotype was not conserved. This could, on the one hand, be explained by the fact that it is an old deletion, with the loss of conservation caused by crossing-over events. On the other hand, we could not rule out that there is a genetic mechanism promoting deletions in this region. If this is the case, it is however remarkable that the breakpoints are exactly the same. The frequency estimate for deletions A and B in a random Belgian cohort lies between 3/1000 and 1,3/10000. Finally, we have screened for patients with isolated PREPL deficiency. They are expected to display all HCS symptoms, except cystinuria type I. Due to the phenotypic similarities, patients with Prader-Willi syndrome (PWS)-like phenotype, but without PWS genotype were selected as candidates. However, no pathogenic variations were found in the 34 PWS-like patients that we have screened. As it is clear that the disruption of SLC3A1 leads to isolated cystinuria type I, the other aspects of the phenotype are likely to result from functional inactivation of PREPL. PREPL is a ubiquitously expressed gene, with highest expression being found in brain, skeletal muscle, kidney and heart. A complex splicing pattern in the 5’ untranslated region was observed, which results in two protein isoforms, PREPLS (638 aa) and PREPLL (727 aa). Both isoforms are identical, except for an additional 89 amino acids at the aminoterminus in PREPLL. Both isoforms are located in the cytoplasm. PREPL shows homology with PREP and OpdB, two serine oligopeptidases with a preference for proline and a basic residue, respectively. Similar secondary structure elements are predicted, with the catalytic residues being conserved at topologically equivalent positions. However, it should be noted that there are also striking differences at both termini. Nevertheless, we postulate that PREPL is a novel member of the prolyl endopeptidase family (clan SC, family S9a). The first experimental evidence that PREPL is an active enzyme was obtained using an activity-based probe, FP-biotin. Both PREPLS and PREPLL react with the probe, indicating that the catalytic machinery is intact and functional. This reaction was abolished when the catalytic residues were mutated into alanines. Moreover, the FP-biotin reaction was inhibited by typical serine protease inhibitors. We then focussed on finding a substrate for PREPL. Initially, candidate substrates based on the phenotype of the patients and homology with OpdB and PREP were tested. Furthermore, we used 3 randomised approaches to show proteolytic activity: the PepChip peptide array, a randomised fluorogenic P1 library and finally a completely degenerate library. All experiments, however, failed to show cleavage by PREPL, whereas substrates were efficiently cleaved by the appropriate controls. In a final approach to find a substrate, we screened a peptidyl a-aminoalkyl phosphonate diester library. The compounds which reduced the FP-rhodamine reaction by more than 60% will be used as a template to generate fluorogenic substrates. Finally we examined the striking differences in the homology with PREPL and OpdB. First of all, we showed that the alanine which is present instead of a glycine at the –2 position of the catalytic serine, a unique feature observed only in PREPL, is not affecting catalytic activity. And secondly, a major difference was the lack of homology at the carboxyterminus. FP-biotin was used to show that the carboxyterminal part of the catalytic domain in PREPL folds into an active conformation, independent of its aminoterminus. This is in contrast with PREP and OpdB, where the presence of the aminoterminal part of the catalytic domain is an absolute requirement for activity. Understanding this unique structural property of PREPL may be the clue in finding a substrate for PREPL. In 1966 werd de eerste familie met het hypotonie cystinurie syndroom (HCS) beschreven. HCS is een autosomaal recessieve aandoening, gekenmerkt door neonatale hypotonie, voedingsmoeilijkheden, groeihormoondeficiëntie, subtiele faciale kenmerken en cystinurie type I. In de loop der jaren werden 12 bijkomende families met vergelijkbare symptomen geïdentificeerd. Het genetisch defect dat aan de basis ligt van HCS zijn deleties op de SLC3A1 locus, waarvan bekend is dat het cystinurie type I veroorzaakt. In totaal werden er in 13 HCS families 5 verschillende deleties gevonden. Vier deleties (A-D) hebben gemeenschappelijk dat ze enkel de coderende sequentie van SLC3A1 en PREPL onderbreken. Daarenboven bleek de expressie van de flankerende genen PPM1B en C2orf34 normaal in EBV getransformeerde lymfocyten. Vermits de deletie van SLC3A1 enkel leidt tot cystinuria type I, werd aangenomen dat de overige aspecten van het fenotype te wijten zijn aan de functionele inactivatie van PREPL. Een laatste deletie (E) die werd gevonden onderbreekt niet enkel de coderende regio van SLC3A1 en PREPL , maar ook die van C2orf34. Haplo-insufficiëntie van C2orf34 zorgt echter niet voor een ernstiger fenotype in de patiënt die deze deletie draagt. In 13 HCS families en 1 cystinurie type I familie, werden deleties D en E slechts eenmaal gedetecteerd, terwijl deleties A (6), B (17) en C (2) verschillende malen werden teruggevonden. Het meermaals voorkomen van deleties A, B en C kan ten dele verklaard worden door een ‘founder’ effect. De frequentie van deleties A en B in een gerandomiseerde Belgische populatie werd geschat op 3/1000 tot 1,3/10000. Het PREPL gen komt breed tot expressie, waarbij de hoogte expressie terug te vinden is in de hersenen. Een complex splicing patroon in de 5’ onvertaalde regio leidt tot 2 proteïnevarianten, PREPLS (638 aminozuren) en PREPLL (727 aminozuren). Beide varianten zijn identiek, met uitzondering van de 89 bijkomende aminozuren aan de aminoterminus van PREPLL. PREPL is homoloog aan PREP en OpdB, twee serine oligopeptidasen met een voorkeur voor proline en een basisch residu, respectievelijk. Een gelijkende secundaire structuur wordt voorspeld, waarbij de katalytische residuen geconserveerd zijn op topologisch equivalente plaatsen. Hierdoor stellen we dat PREPL een nieuw lid is van de prolyl oligopeptidase familie (clan SC, familie S9a). Het eerste experimentele bewijs dat PREPL een actief enzym is werd bekomen door gebruik te maken van een activiteitsgebaseerde probe, FP-biotine. Zowel PREPLS als PREPLL reageren met de probe, wat impliceert dat het katalytisch mechanisme intact en functioneel is. Bovendien wordt geen reactie waargenomen wanneer de katalytische residuen worden gemuteerd naar een alanine residu. Vervolgens werd de focus gelegd op het vinden van een substraat voor PREPL. Initieel werden kandidaat substraten getest, gebaseerd op het fenotype van HCS patiënten en gebaseerd op de homologie met PREP en OpdB. Vervolgens werden 3 gerandomiseerde technieken aangewend om proteolytische activiteit aan te tonen: de PepChip peptide array, een gerandomiseerde fluorogene P1 substraat bank en tot slot een volledig gedegenereerde peptidenbank. Geen van de experimenten toonde een hydrolyse veroorzaakt door PREPL, hoewel substraten wel werden gekliefd na incubatie met een geschikt controle protease. Als laatste benadering om een substraat te vinden werd een peptidyl a-aminoalkyl fosfonaatdiester bank gescreend. Fosfonaten die in staat bleken om de FP-rhodamine reactie met meer dan 60% te inhiberen zullen als model gebruikt worden voor de synthese van fluorogene substraten. Tot slot hebben we de opvallende verschillen in de homologie tussen PREPL en OpdB onderzocht. We toonden aan dat een alanine in plaats van een glycine op de –2 positie van de katalytische serine, een unieke eigenschap van PREPL, de activiteit niet beïnvloedt. Bovendien toonden we aan dat het carboxyterminale deel van het katalytisch domein in PREPL op zichzelf actief is, onafhankelijk van de aminoterminus. Dit in tegenstelling tot zowel PREP als OpdB, waarbij de aminoterminus absoluut noodzakelijk is voor een actieve conformatie. Inzicht in deze unieke structurele eigenschappen van PREPL vormen mogelijk de basis voor het identificeren van een substraat. In 1966, the first family with HCS was described. HCS is an autosomal recessive disorder characterised by neonatal hypotonia, failure to thrive, growth hormone deficiency, minor facial dysmorphic features and cystinuria type I. Over the years, 12 additional families with similar symptoms have been identified. The genetic defect underlying HCS are deletions at the SLC3A1 locus, which is known to cause isolated cystinuria type I. In total, 5 different deletion were found in 13 HCS families. Four deletions (A-D) have in common that only the coding sequences of SLC3A1 and PREPL are disrupted. Expression of the flanking genes PPM1B and C2orf34 was normal in EBV transformed lymphocytes. As it is clear that the disruption of SLC3A1 leads to isolated cystinuria type I, the other aspects of the phenotype are likely to result from functional inactivation of PREPL. One deletion (E) not only disrupts the coding region of SLC3A1 and PREPL , but also of C2orf34 , the gene adjacent to PREPL. Haplo-insufficiency of C2orf34 , however, is not affecting the phenotype in the patient carrying this deletion. In 13 HCS families and 1 cystinuria type I patient, deletion D and E were only found once, while deletion A, B and C were found 6, 17 and 2 times, respectively. The presence for multiple alleles of deletion A, B and C could, at least partially, be explained by a founder effect. The frequency estimate for deletions A and B in a random Belgian cohort lies between 3/1000 and 1,3/10000. PREPL is a ubiquitously expressed gene, with highest expression being found in brain. A complex splicing pattern in the 5’ untranslated region leads to 2 protein isoforms, PREPLS (638 aa) and PREPLL (727 aa). Both isoforms are identical, except for an additional 89 amino acids at the aminoterminus in PREPLL. PREPL shows homology with PREP and OpdB, two serine oligopeptidases with a preference for proline and