Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Worldwide, cancer is a very common disease and a lot of research has been performed about this topic. The body can fight cancer by producing T-cells which, together with other cells of the immune system, can fight the tumor. Immunotherapy is often used to stimulate this process, it uses the body's natural defence system to attack and kill cancer cells. In the natural system antigen presenting cells deliver antigens (characteristic molecules located on the surface of a pathogen or virus) to T-cells. This causes a T-cell proliferation reaction to take place. In a common immunotherapy-treatment, antigen presenting cells can be removed from the body, coated with specific antigens and injected back into the body. In this way, the process of antigen recognition is used to elicit a response against a tumor. The entire process of removing cells from the body, coating them with antigens and injecting them back into the body is expensive and time-consuming. Therefore, artificial antigen presenting cells were developed. These have the same function as human antigen presenting cells and can also be coated with antigens but are easier to make. Polymers, in particular water-soluble polyisocyanopeptide polymers, have been developed as artificial antigen-presenting cells. It has been shown in the past that these polymers present the antigens to T-cells in order to elicit a response. The first goal of this thesis was to investigate why these polymers work so well as antigen presenting cells. Various experiments were performed for this. Cells were activated with a polyisocyanopeptide polymer and fixated on a plate, then a confocal microscope showed where the polymers were located in and around the cell. It was found that the polymers not only activated the T-cells on the outside of the cell, but they also internalized in the cell. Surprisingly, the amount of internalisation was similar compared to activation of T-cells with soluble antibodies. To demonstrate the potential of using polymers as antigen presenting cells, the activation of T-cells with and without polymer bound antibodies was investigated. Release of calcium into the cell is a signal that indicates a cell has been activated. T-cells were activated by polymers coated with antibodies and by loose soluble antibodies. By measuring the release of calcium, it was found that the polymer provides longer activation of the T-cells, despite the fact that the polymer was internalized in a similar extent as the soluble antibodies. In addition, the indirect immunolabeling process was optimized for confocal microscopy. By labelling the internal CD3 receptor of the T-cell receptor complex with specific antibodies, clustering of these receptors can be observed. The aim of these experiments is to investigate whether there is a difference in receptor clustering of Jurkat T-cells activated with polymers presenting antibodies or single soluble antibodies.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Kanker is een ziekte die wereldwijd verantwoordelijk is voor de belangrijkste doodsoorzaak. Een van de vele therapieën die hiertegen gebruikt wordt, is immuuntherapie, waarbij het eigen immuunsysteem ingezet wordt om kankercellen te doden. Dit gebeurt door bepaalde immuuncellen, namelijk dendritische cellen, uit het lichaam van de patiënt te halen, te activeren waardoor activatiemoleculen op de buitenkant van de dendritische cel terechtkomen, en terug in de patiënt te brengen. Deze activatiemoleculen kunnen binden aan T-cellen, de politieagenten van het immuunsysteem, die dan geactiveerd worden (T-cel activatie) en kankercellen zullen doden. Deze behandeling wordt al toegepast, maar is zeer duur en tijdrovend. Een efficiëntere manier om immuuntherapie te verrichten, is door gebruik te maken van artificiële materialen die dezelfde functie hebben als dendritische cellen en T-cellen kunnen activeren. PICs (polyisocyanopeptides) zijn flexibele polymeervezels die gebruikt kunnen worden door er activatiemoleculen op te binden. Eerder onderzoek heeft al uitgewezen dat PICs zeer efficiënt zijn in het activeren van T-cellen en dat de polymeren betere resultaten vertonen dan andere soorten artificiële materialen. Het is echter niet duidelijk waarom deze polymeren zo goed werken. Daarom willen we in een eerste stap van het onderzoek nagaan hoe PICs interageren met T cellen, en in een tweede stap, welk effect ze hebben op de activatie van de cellen. Om de rol van de PIC-vezelstructuur op T-cel activatie te achterhalen, deden we dit enerzijds met activatiemoleculen in oplossing, en anderzijds met activatiemoleculen gebonden op PIC. Om te analyseren hoe de PICs interageren met de T cellen, werden de activatiemoleculen fluorescent gelabeld om ze met microscopie in meer detail te bekijken. Uit het onderzoek bleek dat er meer activatiemoleculen binden met de T cel wanneer ze in oplossing zijn, maar dat ze uiteindelijke voor beide activatiecondities (in oplossing of gebonden op PIC) in gelijke mate worden opgenomen in de T-cel. In de tweede stap onderzochten we welk effect PICs hebben op T-cel activatie, door te kijken naar signaalmoleculen aan de binnenkant van de cel die mee geactiveerd worden. Om het effect van de PIC na te gaan, analyseerden we verschillende soorten signaalmoleculen die in de geactiveerde T-cel fluorescent gelabeld werden om ze met microscopie op verschillende tijdspunten te visualiseren. Uit deze resultaten constateerden we dat de meeste signaalmoleculen een maximale activatie vertonen na 10 min, wat betekent dat de T-cel activatie een snel proces is. We vonden dat activatiemoleculen in oplossingen leiden tot eenzelfde trend als PIC voor de activatie van signaalmoleculen dus de betere werking van PIC kan niet verklaard worden door deze signalering. We kunnen uit de resultaten van deze snelle signaalmoleculen echter geen complete conclusie trekken over de efficiëntie van T-cel activatie, en plannen om in de toekomst signaalmoleculen die een indicatie zijn van langdurige T-cel activatie te onderzoeken. Alles samengenomen is dit onderzoek een eerste belangrijke stap in de ontwikkeling van een goedkopere en snelle immuuntherapie die niet alleen ingezet kan worden voor het bestrijden van kanker, maar eventueel ook voor andere infecties.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Mechanobiologie, de studie die het effect van mechanische signalen op cellen onderzoekt, maakt snel vorderingen, waarbij het belang van mechanische krachten in ziekten niet meer te onderschatten valt. Dit zien we bijvoorbeeld in Cerebrale Cavernous Malformaties (CCM) , een genetische aandoening waarbij abnormale bloedvaten in de hersenen ontstaan in 0.5% van de mensen wereldwijd. Het veroorzaakt symptomen als epilepsie, extreme hoofdpijn, hemorragische beroertes en verlamming, met chirurgische resectie als de enige remedie. Eerder onderzoekt duidt op het belang van mechanische krachten in de ontwikkeling van de ziekte, waardoor een beter inzicht op de cellulaire mechanische signalen cruciaal is. Deze thesis richt zich op het verder ontwikkelen van hulpmiddelen om de ontwikkeling van CCM. In het onderzoek werden speciale spanningssensoren gemaakt die mechanische veranderingen in cellen kunnen meten door middel van twee fluorescerende eiwitten (donor en acceptor) die meer of minder licht uitzenden afhankelijk van hun onderlinge afstand. Deze sensoren werden getest in verschillende celtypes, waaronder menselijke cellen van bloedvaten in de hersenen. Een belangrijk onderdeel van het onderzoek was het verbeteren van deze sensoren om nauwkeurigere metingen te verkrijgen. Hierbij werd ontdekt dat de acceptor mScarlet-I een zeer effectief fluorescerend eiwit is vanwege zijn hoge efficiëntie en goede samenwerking met de donor, Clover. Ook werd een andere acceptor, ShadowY, getest en bleek veelbelovend voor het meten van meerdere spanningen tegelijkertijd in dezelfde cel. De sensoren werden getest met verschillende soorten "veren" die verschillende niveaus van spanning kunnen meten. Dit bleek belangrijk omdat de stijfheid van de veren invloed had op de meetresultaten. Spanningssensoren voor specifieke mechanosensitieve eiwitten, zoals vinculin en VE-cadherine, werden ontwikkeld om te kijken hoe cellen met elkaar en met hun omgeving verbinden. Deze sensoren werden ook getest in cellen die genetisch gemanipuleerd waren om CCM na te bootsen. De resultaten toonden aan dat de sensoren veranderingen in de celstructuur konden detecteren, hoewel sommige onverwachte resultaten verder onderzoek vereisten. Kortom, dit onderzoek heeft laten zien dat het mogelijk is om nauwkeurige spanningssensoren te maken voor het bestuderen van CCM. Het werk heeft ook enkele gebieden geïdentificeerd die verdere verbetering nodig hebben, zoals de efficiëntie van het introduceren van deze sensoren in cellen. Deze bevindingen bieden een goede basis voor toekomstig onderzoek en verdere ontwikkelingen in de mechanobiologie.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Cystische fibrose (CF), ook wel mucoviscidose genoemd, is een zeldzame, progressieve erfelijke ziekte die veroorzaakt wordt door een fout in het ‘cystic fibrosis transmembrane conductance regulator’ (CFTR) gen. Het CFTR proteïne is een essentieel chloride kanaal aanwezig in het apicale membraan van epitheelcellen in meerdere organen waaronder de luchtwegen, het spijsverteringsstelsel en het voortplantingsstelsel. Mutaties in het CFTR gen die leiden tot een niet functioneel proteïne, of zelfs de afwezigheid van het proteïne, resulteren in ernstige symptomen in deze weefsels. Momenteel zijn er geneesmiddelen op de markt die het mutante eiwit beter helpen in zijn werking. Deze zijn beschikbaar voor 90% van de CF patiëntenpopulatie. Voor de resterende 10% CF patiënten is er echter nog geen CFTR-specifieke behandeling beschikbaar. Deze subpopulatie van patiënten hebben voornamelijk zeldzame en vaak ernstige CFTR mutaties. In deze thesis werden twee recent ontwikkelde gen modificatie strategieën onderzocht, om een CFTR mutatie te corrigeren die niet reageert op huidige medicatie. Als eerste werd er gebruik gemaakt van de genmodificatie technologie Base Editing. Base editors zijn in staat om één welbepaalde base in een specifieke DNA regio te wijzigen. Base editors maken hiervoor gebruik van een Streptococcus pyogenes Cas9 proteïne (SpCas9) dat gefuseerd is aan een nucleotide deaminase domein. Een guide RNA (sgRNA) wordt ontworpen die de Base Editor naar de specifieke DNA regio gidst. Het SpCas9 proteïne knipt vervolgens één van de twee strengen van het DNA open. De DNA-bases in deze enkelstrengige DNA sequentie worden blootgesteld aan het nucleotide deaminase en kunnen zo gewijzigd worden. De CFTR mutatie die ik onderzocht, is een puntmutatie die een cytosine base (C) omzet in een guanine base (G). In dit onderzoek heb ik gebruik gemaakt van de meest nieuwe klasse van Base Editors, namelijk de ‘C-naar-G base editor’ (CGBE) om de CFTR mutatie te corrigeren. Een sgRNA molecule werd ontwikkeld om de CGBE naar de genomische sequentie te gidsen. De Base Editor machinerie en de sgRNA werden binnengebracht in HEK293T cellen (Human Embryonic Kidney 293 cells) met behulp van transfectie. Helaas heb ik met deze genmodificatie technologie, geen correctie van de mutatie kunnen waarnemen. Als alternatieve genmodificatie technologie, heb ik het gebruik van Prime Editing (PE) onderzocht om de CFTR-mutatie te corrigeren. PE is een techniek die rechtstreeks nieuwe genetische informatie kan schrijven in een specifieke DNA sequentie. Het PE-systeem werd in dit onderzoek geoptimaliseerd om dezelfde C>G mutatie te corrigeren. Het PE-systeem heeft ook een guide RNA (pegRNA) molecule nodig om het naar de juiste DNA locatie te gidsen. De PE-machinerie tezamen met de pegRNA , werd binnengebracht in HEK293T cellen met behulp van transfectie. DNA analyse heeft aangetoond dat de gebruikte PE-strategie resulteerde in significante correctie van de CFTR mutatie in HEK293T cellen. Als laatste werd onderzocht of deze gen-correctie zich ook vertaalde in de productie van een functioneel CFTR proteïne. Met behulp van Western Blotting heb ik de aanwezigheid van het CFTR proteïne kunnen detecteren en met behulp van een halide sensitieve (HS)-YFP quenching techniek hebben we CFTR-kanaal functionaliteit kunnen bevestigen. In dit onderzoek heb ik kunnen aantonen dat het PE-systeem het fenotype van de onderzochte CFTR mutatie in HEK293T cellen kon herstellen.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Tijdens deze masterthesis onderzoekt de ontwikkeling en optimalisatie van optogenetische tools in zoogdiercellen. Door RhoA en guanine nucleotide exchange factor (GEF) proteinen samen te voegen met het optogenisch CRY2/CIBN systeem kunnen mechanotransductie signaalwegen geactiveerd en gecontroleerd worden Mechanotransductie is het proces waarbij cellen mechanische stimuli omzetten in biochemische signalen en speelt een belangrijke rol in diverse cel functies, processen en ook ziektes. De RhoA signaalweg, essentieel in mechanotransductie signalering, kan worden gecontroleerd door het samenbrengen van interagerende proteinen met behulp van blauw-licht gecontroleerde optogenetica. RhoA bevindt zich in het plasmamembraan waar het geactiveerd kan worden door GEF. Het CRY2/CIBN optogenetisch systeem maakt gebruik van de lokalisatie van RhoA aan het membraan door het bindende partner van CRY2 te verankeren aan het membraan samen met de fluorescente reporter, EGFP. CRY2 is samengevoegd met GEF en mCherry en kan vrij diffunderen in het cytosol. Bij blauwlichtactivering wordt CRY2 foto-geactiveerd en bindt het met zijn bindende partner CIBN aan het membraan, waardoor GEF kan interageren met RhoA aan het membraan en de activering van de mechanotransductiesignaalwegen. Tijdens het masterproject werden verschillende dierlijke cellen gecultiveerd en getransfecteerd met optogenetische genen om de localisatie en rekrutering van deze optogenische componenten naar doelwit-celstructuren te visualiseren. Verschillende strategiën voor fotoactivatie van CRY2 werd toegepast, maar een laag mCherry-signaal en onstabiele transfectieverhoudingen bemoeilijkten het proces.Translocalisatie van CRY2 naar het membraan en mitochondriën kon vastgelegd worden met fluorescente beelden. Desondanks waren de data van de kwantitatieve intensiteits analyses inconsistent met eerder gerapporteerde kinetische trends. Dit was waarshcijnlijk het gevolg van lage signaal-ruisverhouding, variatie in de gegevens door oneven transfectie niveau’s en laag mCherry signaal. Bovendien werd de RhoA-activatie door recruitering van GEF naar het membraan onderzocht met Traction Force Microscopy (TFM), maar de gegevens waren niet consistent met de literatuur en optimalisatie van het proces bleek nodig voor betrouwbare resultaten. Ondanks de uitdagingen, toont deze thesis aan dat optogenetica handig kunnen zijn om specifieke celprocessen te controleren zonder invasieve methoden te gebruiken. Hoewel de resultaten niet overeenstemden met eerder gerapporteerde trends, werden de eerste stappen naar een succesvolle implementatie van optogenetica gezet door een werkend microscoop protocol op te maken. Bovendien werden de eerste stappen gezet voor verdere optimalisatie van transfectie, imaging en combinatie met andere onderzoeksmethoden naar mechanotransductie. Deze thesis draagt bij aan het implementeren en optimaliseren van nieuwe methoden voor de studie van mechanotransductie in zoogdiercellen in het gastlabo.