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Rheumatoid arthritis (RA) is a common joint disease of unknown origin. The inflammatory process of the synovium leads to joint destruction and is clinically associated with pain, swelling and joint stiffness. Its therapy includes corticosteroids, nonsteroidal anti-inflammatory drugs as well as the use of one of more disease-modifying antirheumatic drugs such as methotrexate, leflunomide, antimalarials, gold salt, and other immunomodulating drugs. Whenever used alone or in combination, the above mentioned drugs are unable to stop joint destruction in the majority of patients. During the last decades, many studies have pointed out the major role plaid by tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) in the pathophysiology of RA, and accordingly, several pharmaceutical companies have developed agents which, by blocking TNF-α, have the capacity to stop joint destruction. The most frequently used preparations are : (1) etanercept, a dimeric fusion protein fully human, (2) infliximab, a chimeric monoclonal antibody and (3) adalimumab, a fully human monoclonal antibodies. Two other preparations have been more recently introduced in the market, namely () golimumab, a fully human monoclonal antibody and (2) certolizumab pegol, a fragment of human antibody conjugated with polyethylene glycol. The introduction of these biological agents has dramatically changed the therapeutic approach of RA La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie articulaire inflammatoire fréquente. L’inflammation de la synoviale conduit à une destruction parfois rapide de l’articulation et se traduit cliniquement par un gonflement douloureux, un enraidissement articulaire et un handicap majeur. Le traitement de la PR fait appel à des méthodes kinésiques, orthopédiques et parfois des interventions chirurgicales. Pendant près d’un demi-siècle, l’arsenal médicamenteux comprenait des anti-inflammatoires stéroïdiens, des anti-inflammatoire non-stéroïdiens et des médicaments, dits de fonds, d’action retardée ou lente dont les principaux représentants sont le méthothrexate, le léflunomide, la sulfasalazine, les antipaludéens de synthèse, les sels d’or et divers autres agents immunosuppresseurs. Qu’ils soient utilisés seuls ou en association, ces divers médicaments n’entraînent une rémission de la maladie que de manière très inconstante et sont souvent incapables d’arrêter le processus de destruction articulaire. Au cours des dernières décennies, diverses études ont montré que la cachectine ou « tumor necrosing factor alpha » (TNF-α) jouait un rôle important dans la destruction articulaire de la PR. Dès lors, plusieurs firmes pharmaceutiques ont développés des inhibiteurs du TNF-α qui se sont révélés être capables d’arrêter les érodions ostéo-cartilagineuses des articulations malades. Les trois préparations le splus utilisées sont : (1) l’étanercept, une protéine de fusion dimérique entièrement humaine, (2) l’infliximab, un anticorps monoclonal chimérique, et (3) l’adalimumub, un anticorp monoclonal entièrement humain. D’autres préparations actuellement moins utilisées incluent : (1) le golimumab, un anticorps monoclonal entièrement humain, et (2) le certolizumab pegol, un fragment d’anticorps humain conjugué du polyéthylène glycol. Le développement de ces agents biologiques représente un progrès thérapeutique important en rhumatologie

Arthritis, Rheumatoid --- Tumor Necrosis Factor-alpha

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Obesity belongs to a cluster of metabolic abnormities (insulin resistance, type 2 diabetes, hypertension, dyslipidemia and hypofibrinolysis) leading to an increased risk for cardiovascular disease. These related disorders are components of the metabolic syndrome. It has become clear from epidemiological studies that some increase in the adipose tissue mass antedates the development of other metabolic disorders. However, the cellular and molecular basis of this connection is still elusive.
Adipocytes secrete a large number physiologically active peptides, that often share structural properties of cytokines, and are therefore referred to collectively as “adipocytokines”. One of these, adiponectin (ApN), might be able to counteract several abnormal components of the metabolic syndrome. This hormone prevents the development of atheroscerosis, enhances insulin sensibility increases muscle fatty oxidation and causes weight loss in mice.
The in vivo effects of early and long term overproduction of ApN by tissue adipose itself are currently unknown.
The aim of the present work was two-fold: (1) to generate transgenic mice with targeted overexpression of ApN to adipose tissue and (2) genotype the animals.
The plasmid that direct fat-specific ApN expression was constructed in three steps using standard cloning procedures. First, a – 5.4 kb fragment of the adipocyte P2 (aP2) promoter gene was inserted upstream of the murine ApN cDNA. Second, polylinkers sites were added into pcDNAI vector to allow further excision of the appropriate DNA construct. Third, fused aP2 promoter ApN cDNA was cloned into pcDNAI upstream of the SV40 intron and polyadenylation signal. For microinjection, a 7.4 kb DNA fragment containing the aP2 promoter, ApN, cDNA, intro, andpolyadenylation site was obtained free of a vector sequences by Sac II digestion and gel purification. This fragment was microinjected in FVB zygote, which were re-implanted in FVB pseudo-pregnant mice. Microinjections were performed by Eurogentec Life Technologies.
Out of one hundred microinjected eggs, 28 mice were born, from which 9 turned out of carry the transgene. Transgenic mice were screened by PCR on tail DNA. The identification of positive animals which carried from 2 to > 100 copies was further confirmed by Southern blotting.
For detailed characterization of mouse phenotype, the transgenic lines overexpressing the highest levels of the transgene, as detected by mRNA analysis, combined with the highest levels of plasma ApN, will be selected over the first generation.
These animals should be helpful to gain insight into the potential in vivo repercussions of early and long term targeted overproduction of ApN by adipose tissue in several physiological or pathophysiological conditions. These studies should potentially open new therapeutic perspectives for the metabolic syndrome L’obésité pourrait être un facteur déterminant, si pas causal, dans l’association de diverses anomalies métaboliques prédictives de maladies cardiovasculaires (insulinorésistance, diabète de type 2, hypertension artérielle, dyslipidémie et hypofibrinolyse). L’ensemble constitue le syndrome plurimétabolique, véritable problème de santé publique, dont les mécanismes cellulaires et moléculaires restent encore mal connus. Le tissu adipeux s’est révélé capable de sécréter un grand nombre de molécules bio-actives (adipocytokines et pourrait, peut-être par ce biais, être impliqué dans la pathogénie de ce syndrome.
Une de ces adipocytokines, l’adiponectine (ApN) a retenu notre attention. Contrairement aux autres facteurs adipocytaires, ses taux circulants sont réduits chez les patients obèses ou présentant un syndrome plurimétabolique. Cette hormone pourrait potentiellement contrecarrer plusieurs facettes du syndrome plurimétabolique. En effet, elle exerce des propriétés anti-athérogènes. De plus, elle présente des effets anti-diabétiques en augmentant la sensibilité à l’insuline et « anti-obésité » en favorisant l’oxydation préférentielle des acides gras. Les répercussions in vivo d’une élévation précoce et chronique d’ApN, a fortiori, celle émanant d’une production accrue par l’adipocyte même sont, à ce jour, inconnues.
Pour tenter de les appréhender, nous avons créé des souris transgéniques surexprimant sélectivement l’ApN dans le tissu adipeux. Le but de mon travail a été double (1) participer à la construction du transgène et (2) au génotypage des souris.
La construction du transgène s’est réalisée en trois étapes. Nous avons tout d’abord inséré le promoteur du gène codant pour un transporteur d’acides gras spécifique au tissu adipeux (aP2) en amont de l’ADNc et de l’ApN murin, ciblant ainsi spécifiquement l’expression de ce dernier dans le tissu adipeux. Nous avons ensuite préparé un vecteur receveur (plasmide pcDNAI), notamment par addition de polylinkers devant permettre la libération du transgène final. Finalement, nous avons inséré le tandem aP2-ApN en amont à la queue polyA du vecteur receveur. Le transgène de 7.4 kb (qui contient le promoteur aP2 ; l’ADNc ApN, un intron et le site de polyadénylation) a été libéré de son vecteur après digestion par Sac II, puis purifié. Ce transgène a été injecté dans le pronucleus mâle d’œufs fécondés, puis réimplantés dans l’utérus de femelles pseudogestantes (Eurogentec).
Une centaine d’œufs ont été injectés, 28 souriceaux sont nés dont 8-9 se sont révélés positifs par PCR et Southern Blot. A notre grande satisfaction, le nombre de copies du transgène intégré dans le génome des souriceaux varie de 2 à plus de 100.
Nous comptons sélectionner les lignées fondatrices sur base de l’expression des ARNm dans le tissu adipeux et des taux circulants d’ApN dans le plasma chez les souris positives de la première génération, puis commencer la caractérisation du phénotype.
Ces animaux devraient nous permettre d’étudier les répercussions potentielles d’une surexpression précoce et prolongée d’ApN, produite spécifiquement par le tissu adipeux, dans divers contextes physiologiques ou physiopathologiques. A terme, ces études pourraient peut-être déboucher sur de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le cadre du syndrome plurimétabolique

Mice --- Transgenes --- Obesity --- Tumor Necrosis Factor-alpha --- Interleukin-6

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The adipocyte-derived hormone, ACRP30 (adipocyte complemented related protein of 30 kDa) affects body weight, increases fatty-acid oxidation and enhances insulin sensivity. As catecholamines play a major role in fuel homeostasis, we have studied the effects of β-adrenergic agonists and cAMP, their second messenger, in ACRP30 gene expression, protein production and secretion in mouse in vitro and in vivo.
After 10h of culture, cAMP decreased ACRP30 secretion by mouse adipose explants. This decrease was due to a marked depletion of tissues ACRP30 protein and mRNA levels. Moreover, in the presence of cAMP, ACRP30 secreted in the medium migrated as two species of apparent molecular masses of 32 and 30 kDa. The former, which was also detected in control medium, was sorted into secretory vesicles associated with the membrane fraction. The latter could be an immature form that did not undergo post-translational modifications and was exported after emptying of an intracellular pool, recovered in the cytosol fraction. These dual effect of cAMP were mimicked by β-adrenergic agonists, the selective β3 (BRL 37344) being the most potent in vitro. The agonist was tested in vivo. Administration of BRL 37344 to mice caused a 40-50 % reduction of ACRP30 mRNA levels in visceral and subcutaneous adipose depots and a 60% decrease in plasma ACRP30 levels
in conclusion, cAMP and β-adrenergic agonist exert a dual (pre- and post- translational) effect on ACRP30 secretion in culture mouse adipose explants. The inhibitory effect of β-adrenergic agonists was reproduced in vivo. The decrease in ACRP30 may be a novel, β-adrenoceptor-mediated mechanism, by which catecholamines affect fuel homeostasis. As ACRP30 stimulates fatty-acid oxidation and thermogenesis, the ability of catecholamines to decrease ACRP30 production suggest an inhibitory feed-back role for these hormones Le tissu adipeux est l’un des déterminants majeurs de la biodisponibilité des lipides circulants. Les catécholamines, par le biais des récepteurs β-adrénergiques, sont les hormones lipolytiques par excellence. De plus, elles stimulent la thermogenèse et l’oxydation des acides gras. Outre son rôle dans le stockage et la mobilisation des triglycérides, l’adipocyte a une fonction endocrine propre. L’ACRP30 (adipocyte complement related protein of 30 kDa) est une hormone adipocytaire qui, en favorisant l’utilisation préférentielle des substrats énergétiques (oxydation des acides gras) et en augmentant la sensibilité à l’insuline, influence le métabolisme et l’homéostasie énergétique. Nous avons étudié les effets des catécholamines (et plus particulièrement ceux des agonistes des récepteurs β-adrénergiques et de leur second messager, l’AMPc) sur l’expression du gène, la production et la sécrétion d’ACRP30 chez la souris in vitro (explants de tissu adipeux) et in vivo.
Après 10 heures de culture, l’AMPc a diminué la sécrétion d’ACRP30 par les explants, suite à une déplétion du contenu intra-tissulaire de la protéine, elle-même consécutive à une réduction du taux des ARNm correspondants. Par ailleurs, l’AMPc a dissocié l’ACRP30 secrétée en deux isoformes de poids moléculaires distincts (32 et 30 kDa), cette dernière correspondant à la vidange d’un « pool » intra-adipocytaire cytosolique. L’isoforme de 30 kDa n’aurait pas subit de modifications post-traductionnelles, contrairement à celle de 32 kDa et pourrait être plus instable et plus facilement dégradée.
Ce double effet sur ACRP30 a été reproduit par le β-agonistes. A cet égard, l’agoniste β3 (BRL37344) qui s’est révélé particulièrement puissant in vitro a été testé in vivo. Des souris injectées au BRL 37344 ont vu leur taux d’ARNm ACRP30 réduit de 40 à 50 % dans les sites adipeux viscéraux et inguinaux et leur concentration plasmatique d’ACRP30 chuter de 60%.
En conclusion, l’AMPc et les agonistes des récepteurs β-adrénergiques exercent un double effet (pré- et post-traductionnel) sur la sécrétion d’ACRP30 dans des cultures d’explants de tissu adipeux de souris. L’effet inhibiteur est retrouvé in vivo. Cette inhibition de la sécrétion d’ACRP30 par les agonistes β-adrénergiques pourrait, par une boucle de rétrocontrôle, contrecarrer l’oxydation des acides gras et la thermogenèse induites par l’ACRP30

Adrenergic beta-Agonists --- Receptors, Catecholamine --- Tumor Necrosis Factor-alpha --- Genes, Bacterial

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Cancer is a pathological process caused by the appearance of an abnormal cell which increases in an uncontrolled way. To be able to multiply, the tumoral cells need much oxygen and energy. The more the cell divides, the more it moves away from the vessel which irrigated it. Consequently, the hypoxic areas will be born. To be able to continue to multiply, the cancer cell will have to create new blood-vessels. This phenomenon is called the angiogenesis and started by a growth factor: the VEGF. But these new vessels are dilated, very permeable and will cause plasmatic protein escapes which will increase the pore water pressure. This rise of pressure of tissues towards blood will constitute one of the main barriers of the access of the drugs to the tumor. This is why, improving oxygenation and the tumoral perfusion, via amongst other things the modulation of tonicity and the vascular endothelia, the interstitial pressure decrease or hyperthermia, seems to be a promising track to improve the access of the drug to the tumor.
Some techniques already used in private clinic like the functional imagery or the angiography via CT-scan with iodine already make it possible to characterize these hemodynamics factors. But within sight of the positive results of the various non-invasive tools developed in this memory, a future application in private clinic seems to be possible Le cancer est un processus pathologique provoqué par l’apparition d’une cellule anormale qui se multiplie de façon incontrôlée. Pour pouvoir se multiplier, les cellules tumorales ont besoin de beaucoup d’oxygène et d’énergie. Au plus la cellule se divise, au plus elle s’éloigne du vaisseau qui l’irriguait. Dès lors, naîtront des régions hypoxiques. Pour pouvoir continuer à se multiplier, la cellule cancéreuse va devoir créer de nouveaux vaisseaux sanguins. Ce phénomène est appelé l’angiogenèse et est déclenché par un facteur de croissance : le VEGF. Mais ces nouveaux vaisseaux sont dilatés, très perméables et vont provoquer des fuites de protéines plasmatiques qui augmenteront la pression interstitielle. Cette hausse de pression des tissus vers le sang constituera l’une des barrières principales de l’accès du médicament à la tumeur. C’est pourquoi, vouloir améliorer l’oxygénation et la perfusion tumorale, via entre autre la modulation du tonus et de l’endothélium vasculaires, la diminution de la pression interstitielle ou encore via l’hyperthermie, semble être une piste prometteuse pour améliorer l’accès du médicament à la tumeur.
quelques techniques déjà utilisées en clinique comme l’imagerie fonctionnelle ou encore l’angiographie via le CT-scan à l’iode permettent déjà de caractériser ces facteurs hémodynamiques/ mais au vu des résultats positifs des différents outils non invasifs développés dans ce mémoire, une application future en clinique semble être envisageable

Neoplasms --- Angiogenesis Modulating Agents --- Vascular Endothelial Growth Factor --- Chemotherapy --- Tumor Necrosis Factor-alpha

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Growth Inhibitors --- Interferon-gamma --- Tumor Necrosis Factor-alpha --- Cholestasis --- physiology --- blood