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T-LYMPHOCYTES, CYTOTOXIC --- IMMUNOLOGY --- T-LYMPHOCYTES, CYTOTOXIC --- IMMUNOLOGY

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T-Lymphocytes, Cytotoxic --- HLA Antigens --- Epitopes --- immunology

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Un ADNc nommé RAGE a été identifié récemment dans le laboratoire comme responsable de l’expression de l’antigène LE9211-A, qui est reconnu par un clone CTL autologue sur la lignée de la tumeur rénale LE9211-RCC. Ce clone d’ADNc n’étant pas complet, nous avons recherché la séquence complète de l’ADNc du gène RAGE. Au départ de l’ADNc des cellules LE9211-RCC, nous avons amplifié par une PCR spécifique l’extrémité 5’ de l’ADNc RAGE, ce qui a permit d’obtenir 183 pb supplémentaires. Parallèlement, nous avons ciblé une bibliothèque d’ADNc de la lignée LE9211-RCC par hybridation avec l’ADNc RAGE. Ceci nous a permis de mettre en évidence 3 ADNc supplémentaires ayant des séquences apparentées au gène RAGE. Ils ont été appelés RAGE-2, RAGE-3 et RAGE-4, alors que l’ADNc isolé initialement (clone 9h3) a été appelé RAGE-1. Ces différents ADNc ont été séquencés et ils possèdent une taille de 1168 pb, 1235 pb et 2050 pb respectivement. Par rapport à l’ADNc RAGE-1, les clones RAGE-2, 3 et 4 possèdent tous une insertion de 37 pb correspondant à la fin d’un intron. De plus, RAGE-3 possède une seconde insertion de 47 pb. Quant à RAGE-4, il possède à son extrémité 3’ une longue séquence non apparentée à RAGE-1.
Afin de déterminer si ces nouveaux ADNc RAGE codaient également l’antigène LE9211-A, nous avons transfecté ces ADNc dans les cellules COS_7 avec l’ADNc codant la molécule HLA-B7 qui présente l’antigène au CTL 263/17. Les transfectants ont été ensuite testés avec ce clone CTL. Ceci a montré que seul RAGE-1 était capable de transférer l’expression de l’antigène. Sur base de ce résultat, la comparaison des séquences des ADNc RAGE-1 à 4 a permis d’orienter la recherche du peptide antigénique reconnu par le clone CTL 263/17 et présenté par HLA-B7. L’ADN RAGE-1 contient 3 cadres ouverts de lecture (ORF1, ORF2, ORF3). L’ORF1, long de 123 pb, est interrompu par un codon stop dans les ADNc RAGE-2-4 en raison de l’insertion de 37 pb. Ce résultat suggérait que le peptide antigénique dérive de l’extrémité C-terminale de la protéine codée par l’ORF1 de RAGE-1. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons construit des mini gènes englobant la séquence de l’ORF1 de RAGE-1-3 et nous les avons transfectés dans les cellules COS-7. Ceci a permis de confirmer que les 34 derniers acides aminés de la protéine codée par l’ORF1 de RAGE-1 comprenaient effectivement la séquence peptidique.

Medical Laboratory Science --- Kidney Neoplasms --- T-Lymphocytes, Cytotoxic

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Le gène MAGE-4 se caractérise par la présence de huit premiers exons qui sont splicés alternativement à un seul exon 2 et à un seul exon 3. Nous avons mesuré l’activité transcriptionnelle des régions promotrices situées en amont de trois de ces exons 1.
Pour cela, nous avons introduit dans un plasmide rapporteur luciférase les trois régions promotrices de 0.2kb, 0.68kb et 0.6kb respectivement, obtenues après deux exonucléases successives. Les expériences de transfection transitoire dans la lignée cellulaire LB23-SARC, qui exprime MAGE-4 et dans la lignée MZ2-MEL qui ne l’exprime pas ont montré que ces promoteurs sont actifs dans les deux lignées. En transfectant des construction délétées et mutées du promoteur 1.5 de MAGE-4 dans les lignées cellulaires LB23-SARC et MZ-2MAL, nous avons pu déterminer trois régions.
Cis-activatrices appelées A (-179 --> -89), B (-89 --> -41) et C (-41 -->-25). Ces trois régions contiennent des motifs consensus pour des facteurs de transcription de la famille Ets. La région A induit environ 50% de l’activité du promoteur 1.5 dans la lignée LB23-SARC, mais ne semble pas jouer de rôle dans la lignée MZ2-MEL. La région B induit 40% de l’activité du promoteur dans la lignée LB23-SARC et 90% dans la lignée MZ2-MAL. La région C induit environ 10% de l’activité transcriptionnelle dans les deux lignées.
Des expériences de footprinting à la DNAse I ont confirmé que ces trois régions cis-activatrices fixaient des protéines nucléaires de la lignée LB23-SARC.
La technique du retard sur gel avec un extrait nucléaire de cellules LB23-SARC en présence d’oligonucléotides compétiteurs contenant un site consensus Etc nous a montré que les protéines nucléaires se liaient au motif Ets des régions B et C. Des mutations ponctuelles introduites dans les motifs Ets des régions B et C ont confirmé que des facteurs de la famille Ets jouaient un rôle essentiel dans la régulation de l’activité du promoteur MAGE-4.

Antigens, Neoplasm --- T-Lymphocytes, Cytotoxic --- Medical Laboratory Science

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Some studies have shown that cytotoxic T lymphocytes are able to recognize tumor ceNs but tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) seem to have functional defects. The group of Pierre van der Bruggen has shown that the functional impairment observed in tumor-infiltrating lymphocytes could be corrected by treatments with galectin competitor ligands. This suggests that galectins that are abundant in tumors could be responsible for these defects. In contrast with blood CD8 T cells, TIL that were treated with LacNAC, a galectin competitor ligand, and stimulated ex vivo secreted more IFN-y than untreated TIL. We have tried to better understand the defect of TIL by examining whether IFN-y production or secretion is affected. We have also investigated cytoskeleton remodeling which contributes to the secretory machinery. We performed intracellular staining of IFN-y after ex vivo stimulation. No difference was observed between LacNAc-treated and non-treated TIL samples. We also quantified the cytokine mRNA using qPCR. Despite important variations between samples, LacNAc treatment did not seem to influence the level of IFN-y mRNA in TIL. These results indicate that IFN-y is produced after TIL ex vivo stimulation and suggest that the difference observed at the secretion level is neither due to a lack of activation of the TIL nor to a defect in the cytokine production. We temporarily concluded that untreated TIL are poorly able to secrete IFN-y. We have examined TIL by confocal microscopy with a focus on microtubule network and actin cytoskeleton, which have been associated with secretion in lymphocytes. We studied the polarization of the Microtubule Organizing Center (MTOC) of the TIL towards the target. We observed a defect of MTOC docking at the synapse between untreated TIL and antigen presenting cells. MTOC docking was improved in LacNAc-treated TIL. In another unrelated project, we have produced recombinant galectin-1 with the objective to better understand the mechanisms underlying the role of galectins in TIL defects. This protein wiIl be useful in the laboratory to assess, in the future, the ability of galectin-1 and -3 to induce CD8 T cells dysfunction in vitro Plusieurs études ont démontré que les lymphocytes T cytotoxiques, bien qu’équipés pour éliminer les cellules cancéreuses, ne fonctionnent pas correctement lorsqu’ils sont dans les tumeurs. L’équipe de Pierre van der Bruggen a récemment montré que des lymphocytes T CD8 infiltrant les tumeurs (TIL) présentaient des défauts fonctionnels probablement imputables à une protéine abondante dans les tumeurs, la galectine-3. Il a notamment été observé, ex-vivo, que les lymphocytes T CD8 infiltrant les tumeurs, contrairement aux CD8 sanguins montrent un défaut de sécrétion d’interféron-gamma après restimulation. Ce défaut peut être levé par des ligands compétiteurs des galectines, comme le LacNAc. Notre projet s’insère dans les efforts de l’équipe pour mieux comprendre les mécanismes de ces déficiences fonctionnelles et a pour but de déterminer si le défaut se situe au niveau de la production de la protéine ou de sa sécrétion et si des perturbations dans le remodelage du cytosquelette sont impliquées. Nous avons étudié, dans les TIL CD8, la production de l’ARN messager de l’interféron-gamma par PCR quantitative. Nos résultats semblent indiquer que le niveau d’ARN messager est le même dans les TIL qu’ils aient ou non été traités au LacNAc avant d’être stimulés. Nous avons également analysé la production de la protéine par marquage intracellulaire et analyse en cytométrie en flux. La proportion de cellules positives pour l’IFN-y était similaire dans les échantillons traités ou non au LacNAc. Nos résultats suggèrent donc que les TIL soient capables de s’activer et de produire la cytokine mais qu’ils soient incapables de la sécréter correctement. Des défauts de remodelage du cytosquelette de ces TIL pourraient expliquer le déficit de sécrétion d’interféron-gamma observé. En effet, il est connu que l’organisation des microfilaments de tubuline et d’actine participe à l’exocytose des cytokines. Pour étudier cette hypothèse, nous avons développé une technique permettant d’observer, en microscopie confocale, les remodelages du cytosquelette induits par la rencontre entre un lymphocyte T et sa cible. Nous nous sommes intéressés en particulier au centre organisateur des microtubules (MTOC) et à sa polarisation vers la cible du lymphocyte T, à la synapse immunologique. Nous avons observé que, dans les TIL CD8, restimulés ex-vivo, le MTOC ne s’ancre pas toujours à la membrane au point de contact avec la cible, ce qui pourrait expliquer le défaut de sécrétion observé. Un traitement des TIL au LacNAc remédie largement à ce défaut. Certaines expériences, dans la littérature, suggèrent que la galectine-3 pourrait ne pas être seule galectine responsable du dysfonctionnement des lymphocytes T infiltrant les tumeurs. Nous avons donc produit de la galectine-1 recombinante dans le but d’étudier si elle peut induire, in-vitro, ces dysfonctionnements des lymphocytes, seule, ou en combinaison avec la galectine-3.

T-Lymphocytes, Cytotoxic --- Galectins --- Neoplasms --- Lymphocytes, Tumor-Infiltrating