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Testicular Neoplasms.

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Testicular neoplasms: congr.

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Endocrinology --- Testicular Neoplasms

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Testicular Neoplasms --- Genital Neoplasms, Male

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Spermatogenesis is the formation process of spermatozoa from the spermatogonia. It takes place i n the testis, more particularly in the seminiferous tubules. The Sertoli cell is essential for the spermatogenesis because it is the physic and metabolic support of the germ cells. It provides protection and a number of nutrient s, growth factors and other substrates required for the survival and the differentiation. It receives endocrine and paracrine influences which make it possible to mature and differentiate during the puberty and consequently start up the spermatogenesis. The man fertility can decline due to gonadotoxic treatments, more specifically the chemotherapy and radiotherapy which can reduce the pool of germ stem cells. In the prepubertal boy, the spermatogenesis is not initiated yet and the only way to preserve fertility is the cryopreservation of a little fragment of testis tissue which contains spermatogonia. The ln vitro maturation could be a solution to obtain the differentiation of spermatogonial into spermatozoa. The aim of this master thesis is to study the different maturation and functional factors of the Sertoli cell in an organotypic culture of immature human testicular tissue in order to determine if this Sertoli cell can support the in vitro spermatogenesis processThe tissue fragments of 1mm3 of prepubertal patients are put in an organ culture during 139 days. Two culture media are used: one contains testosterone and the other contains the human choriogonadotropin (hCG, a LH-like) inducing the production of endogenous testosterone. Additionally, the two media are supplemented with follicle-stimulating hormone, mimicking the hormonal changes of the puberty. The tissue fragments are removed at specific time. They are embedded in paraffin and cut. They are colored with Hemalum-eosin in order to analyze the integrity of the seminiferous tubules (ST). The integrity is good (60% of the ST are considered as « good integrity »).lmmunochemistries (IHC) are used to bring out the factors of maturity or immaturity of the the Sertoli cell. The secretion of the anti-mullërian hormone (AMH) decreases during the culture, mimicking the peripubertal physiology of the maturation of the Sertoli cell. The proliferation (ki67) of the Sertoli cell increases, then decreases, which could also correspond to the maturation profile of the Sertoli cell. The Glial-derived neurotrophic factor, a functional factor of the Sertol i cell, is also is detected throughout the culture. Assays in the supernatants also allow characterizing the maturation and the functionality of the Sertoli cell. The AMH rate (by and enzymatic assay) decreases, confirming the results of the IHC. The measurement of the Dehydrogenase lactate (LDH, made by photometry) rate is rather high at the beginning of the culture and becomes almost zero at the 1Oth day, showing that there is little necrosis in the culture. Finally, a testosterone detection (by bioluminescence) in the medium supplemented with hCG show that the Leydig cells produce testosterone. ln our organotypic culture of immature testis, Sertoli cells show signs of maturation and functionality. l n the present culture system, any germ cell differentiation was observed. The absence of some growth factors with an in vivo systemic origin or functional disability of Sertoli cells in culture can be the cause and request further analysis. La spermatogenèse est le processus de formation des spermatozoïdes à partir de spermatogonies. Il se déroule au sein du tissu testiculaire, plus particulièrement dans les tubules séminifères. La cellule de Sertoli est une cellule capitale pour la spermatogenèse car elle sert de support physique et métabolique à la cellule germinale en lui fournissant une protection et un grand nombre de nutriments, facteurs de croissance et autres substances propices à sa survie et différenciation. Elle reçoit des influences endocrines et paracrines qui lui permettent de maturer et de se différencier lors de la puberté et ainsi d'enclencher le début de la spermatogenèse. La fertilité de l'homme peut se trouver diminuée par des traitements gonadotoxiques, plus particulièrement par les agents chimiothérapeutiques et radiothérapeutiques qui peuvent réduire la réserve de cellules germinales. Chez le garçon prépubère, pour qui la spermatogenèse n'est pas encore initiée, le seul moyen de préserver la fertilité avant ces traitements est la cryopréservation d'un fragment testiculaire contenant des spermatogonies. La maturation in vitro du tissu peut être une solution envisageable en vue d'obtenir la différenciation des spermatogonies en spermatozoïdes. Le but de ce mémoire est d'étudier différents facteurs de maturation et de fonctionnalité de la cellule de Sertoli dans une culture organotypique de tissu testiculaire immature humain afin de déterminer si cette dernière est capable de supporter le processus de la spermatogenèse in vitro. Des fragments de 1m m3 de tissu testiculaire de patient s prépubères sont mi s en culture organotypique durant 139 jours. Deux milieux de culture sont utilisés : l’un contenant de la testostérone et l’autre l’hormone chorionique gonadotrope humaine (hCG, une substance LH-like) induisant la production de testostérone endogène par action sur les celllules de Leydig. Les deux milieux sont, de surcroit, supplémentés en hormone folliculostimulante, mimant les changements hormonaux de la puberté. Les fragments, retirés à des jours précis, sont enrobés en bloc de paraffine et coupés. Ils sont colorés en hémalun-éosine afin d'analyser l’intégrité des tubules séminifères (TS). Celle-ci s'est révélée être bonne (60% des TS en moyenne sont considérés commeintègres).Des immunohistochimies (IHC) sont réalisées pour mettre en évidence des facteurs de maturité ou d'immaturité de la Sertoli. La sécrétion de l l'hormone antimüllérienne (AMH) diminue au cours de la culture, montrant une maturation de la cellule de Sertoli. La prolifération (Ki67) des cel lules de Sertoli augmente puis diminue, mimant la physiologie péripubère vers la maturation de la cellule de Sertoli. Un facteur de la fonctionnalité de la cellule de Sertoli , le Gl ial-derived neurotrophic factor, est détecté tout au long de la culture.Des dosages dans le surnageant permettent également de caractériser la maturation et la fonctionnalité de la cellule de Sertoli. Le taux d'AMH (par dosage enzymatique) diminue, confirmant les résultats de l 'IHC. La mesure du taux de lactate déshydrogénase (LDH, réalisé par photométrie) est assez haute au début de culture et devient quasi nul au 10ième jour de culture, montrant qu'il y a peu de nécrose dans la culture. Enfin, une détection de testostérone (par bioluminescence) dans le milieu supplémenté en hCG permet de montrer que les cellules de Leydig produisent de la testostérone.Dans notre culture organotypique de tissu testiculaire immature, les cellules de Sertoli montrent des signes de maturation et de fonctionnalité. Dans le système de culture actuel, aucune différenciation des cellules germinales n'est observée. L'absence de certains facteurs de croissance d’origine systémique in vivo ou une incapacité fonctionnelle des cellules de Sertoli en culture peuvent en être les causes et leur détermination nécessite donc un complément d’investigatio

Sertoli Cells --- Sertoli Cells --- Testicular Neoplasms --- Cryopreservation