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Islets of Langerhans

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Metabolic Diseases --- Islets of Langerhans --- Adult

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Islets of Langerhans --- Pregnancy in Diabetics

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Cells, Cultured --- Genetic Engineering --- Islets of Langerhans --- Islets of Langerhans --- cytology --- secretion

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Background and objectives: The mechanism by which glucose (G) inhibits glucagon secretion from α-cells of the endocrine pancreas are still unknown. They might involve a direct of G on α-cells or an indirect effect via non- α-cells. They hypothesis of a direct effect of G an α-cells suggest the involvement of K+ ATP channels, or an inhibition of the efficacy of ca2+ on exocytosis by G. The hypothesis of an indirect effect of G on α-cells suggests that a paracrine factor, i.e. insulin released from β-cells or somatostatin released from δ-cells, is responsible for the G-induced suppression of glucagon secretion (GISG). The purpose of my project was to study the control mechanisms of glucagon secretion by G and two K+ ATP channel modulators, tolbutamide, a K+ ATP channel closer, and diazoxide, a K+ ATP channel opener. My first objective was to test whether G inhibits glucagon secretion by decreasing the efficacy of ca2+ on exocytosis. To answer that question, it was necessary to be under conditions where glucagon secretion was stimulated and α cell [ca2+]c steadily elevated. (2) Secondly, I investigated the role of K+ ATP channels in GISG. The effects of G and K+ ATP channel modulators (tolbutamide and diazoxide) were tested on glucagon secretion from control or SUR1 knockout mice (SUR1-/-). (3) Thirdly, I evaluated whether a β-cells derived factor is responsible for the GISG. (4) Finally, by using somatostatin KO (SUR1-/-) mice, I investigated the role of somatostatin in the control of glucagon secretion by G and by pharmacological modulators of K+ ATP channels.
Materials and methods: Mouse islets were isolated by collagenase digestion of the pancreas and cultured overnight in RPMI1640 medium containing 7 mM of G. Glucagon and insulin secretions from islets were measured in perifusion experiments in the continuous presence of a mixture of aminoacids. α-cells [ca2+]c was also measured in some experiments with a ca2+ sensitive probe (D3cpv) specifically targeted to α-cells within islets.
Results: Increasing the [G] of the perifusion medium inhibited glucagon secretion from control islets. (1) In conditions where [ca2+]c was stable and elevated, G did not affect glucagon secretion but stimulated insulin secretion. (2) When K+ ATP where not functional (in the presence of tolbutamide or diazoxide) or when they were absent (SUR1-/- mice), a rise of the [G] inhibited glucagon secretion. Tolbutamide did not reproduce the inhibitory effect of G because, at 500µM, it did not inhibit glucagon secretion in the absence of G, and it increased glucagon secretion in the presence of 7 mM G (G7). Moreover, diazoxide (5 µM) did not reserve the inhibitory effect of G7. (3) In many experimental conditions, there was a lack of correlation between inhibition of glucagon secretion and stimulation of insulin secretion. (4) Glucagon secretion elicited by 1mM G was higher with Sst -/- than controls islets, and G inhibited glucagon secretion of both types of islets. Moreover, in control islets, tolbutamide decreased glucagon secretion in G1 and G7.
Conclusions: (1) G does not inhibit glucagon secretion by decreasing the efficacy of ca2+ on exocytosis. (2) The observations that tolbutamide does not reproduce the inhibitory effect of G, and that G can inhibit glucagon secretion in the presence of tolbutamide or diazoxide, and in SUR1-/- islets suggest that G can modulate glucagon secretion independently of K+ ATP channels. However, an involvement of these channels cannot entirely be ruled out because GISG was blunted when K+ ATP channels are absent or not functional. (3) Insulin or a β-cell derived factor co-released with insulin is not the paracrine factor responsible for GISG. (4) Somatostatin exerts a tonic inhibitory effect on glucagon secretion and G is able to inhibit glucagon secretion independently of somatostatin. Moreover, tolbutamide would modulate secretion glucagon by two mechanisms: a direct stimulatory effect on α-cell and an indirect inhibitory effect involving stimulation of somatostatin release by δ-cells which would counteract the direct stimulatory effect of tolbutamide on α-cells. The idea that G inhibits glucagon secretion independently of K+ ATP channels is strengthened by the observation that, in Sst -/- islets and whatever the glucose concentration of the medium, tolbutamide never mimics the inhibitory effect of G on glucagon secretion since it always stimulates glucagon secretion Contexte et objectifs : On ignore toujours les mécanismes par lesquels le glucose (G) inhibe la sécrétion de glucagon par les cellules α du pancréas endocrine. Certaines hypothèses suggèrent un effet direct du G sur la cellule α. Cet effet pourrait impliquer les canaux K+ ATP et/ou résulterait d’une inhibition de l’efficacité du ca2+ sur l’exocytose. Un effet indirect du G est aussi envisagé et ferait intervenir une régulation paracrine des produits sécrétés par les cellules β ou δ, et qui inhiberaient la sécrétion du glucagon en réponse au G, et à deux modulateurs pharmacologiques des canaux K+ ATP, le tolbutamide qui les ferme, et le diazoxide qui les ouvre. (1) Premièrement, j’ai voulu savoir si le G modulait l’efficacité du ca2+ sur l’exocydose, une inhibition rendant compte de l’effet glucagonostatique du G. Pour répondre à cette question, il était tout d’abord nécessaire de se mettre dans les conditions où la [ca2+]c des cellules α est élevée et stable et où la sécrétion de glucagon est stimulée. (2) Je me suis ensuite intéressée au rôle tenu par les canaux K+ ATP dans l’inhibition de la sécrétion du glucagon par le G (ISGG). Les effets du G et de modulateurs des canaux K+ ATP (tolbutamide ou diazoxide) ont été testé sur la sécrétion de glucagon d’îlots de souris contrôles ou qui ont perdu l’expression du gène codant la sous-unité SUR1 des canaux K+ ATP (SUR1-/-). (3) J’ai aussi voulu savoir si l’insuline était responsable de l’ISGG. (4) Finalement, en utilisant des souris contrôles ou Knock-out pour le gène de la somatostatine (Sst-/-), j’ai évalué le rôle de la somatostatine dans le contrôle de la sécrétion de glucagon par le G et des modulateurs pharmacologiques des canaux K+ ATP.
Matériels et méthodes: Les îlots de souris ont été isolés par digestion à la collagénase du pancréas et cultivés pendant une nuit dans le milieu RPMI1640 contenant 7mM de G. Les sécrétions de glucagon et d’insuline ont été déterminées par périfusion d’îlots en présence continue d’un mélange d’acides animés. Dans certaines expériences, la [ca2+]c des cellules α a été mesurée en utilisant une sonde fluorescente sensible au ca2+ (D3cpV) spécifiquement adressée aux cellules α.
Résultats : Une augmentation de la [G] inhibe la sécrétion de glucagon d’îlots de souris contrôles. (1) Dans des conditions où la [ca2+]c est maintenant stable et élevée, le G n’affecte pas la sécrétion de glucagon alors qu’il augmente la sécrétion d’insuline. (2) Lorsque les canaux K+ ATP sont non fonctionnels (en présence de tolbutamide ou de diazoxide) ou lorsqu’ils sont absents (souris SUR1-/-), une augmentation de la [G] inhibe la sécrétion de glucagon. Aussi, le tolbutamide ne reproduit pas l’effet inhibiteur du G car, à 500µM, il n’inhibe pas la sécrétion de glucagon en absence de G et il augmente la sécrétion de glucagon en présence de 7mM de G (G7). De plus, le diazoxide (5µM) ne renverse pas l’effet inhibiteur de G7. (3) Dans de nombreuses conditions expérimentales, une inhibition de la sécrétion du glucagon par le G n’est pas corrélée avec une stimulation de la sécrétion d’insuline. (4) La sécrétion de glucagon en G1 est plus élevée à partir d’îlots de souris Sst -/- qu’à partir d’îlots de souris contrôles, et le G est toujours capable d’inhiber la sécrétion de glucagon en G1 et la stimule en G7. Dans les îlots Sst -/- , il stimule la sécrétion de glucagon tant en G1 qu’en G7.
Conclusions : (1) Le G ne diminue pas l’efficacité du ca2+ sur l’exocytose des granules de glucagon. (2) Les observations que le tolbutamide ne produit pas l’effet inhibiteur du G, et que le G est capable d’inhiber la sécrétion de glucagon en présence de tolbutamide ou de diazoxyde, et dans des îlots SUR1 -/- , suggèrent que le G inhibe la sécrétion de glucagon indépendamment des canaux K+ ATP. Cependant, l’implication des canaux ne peut être exclue étant donné que l’ISGG est moindre dans des îlots contrôles dont les canaux K+ ATP sont non fonctionnels ou dans des îlots SUR1-/- que dans des îlots contrôles. (3) L’insuline ne serait pas le facteur inhibiteur paracrine responsable de l’ISGG. (4) Enfin, la somatostatine exercerait un effet tonique inhibiteur sur la sécrétion de glucagon et le G inhiberait la sécrétion de glucagon indépendamment de la somatostatine. De plus, le tolbutamide modulerait la sécrétion de glucagon par deux mécanismes distincts : un effet stimulant direct sur les cellules α, et un effet inhibiteur indirect qui résulterait de la stimulation de la sécrétion de somatostatine et qui s’opposerait à l’effet stimulateur direct du tolbutamide sur la cellule α. L’idée que le G inhibe la sécrétion de glucagon indépendamment des canaux K+ ATP de la cellule α est renforcée par l’observation que le tolbutamide stimule, mais n’inhibe pas, la sécrétion de glucagon d’îlots de souris Sst-/- quelle que soit la concentration de G du milieu

Islets of Langerhans --- Glucagon-Secreting Cells --- KATP Channels