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Le diagnostic de la paratuberculose est gêné par le manque de sensibilité et de spécificité des tests immunologiques disponibles jusqu’à présent. En effet, ils permettent difficilement d’identifier les animaux infectés par Mycobacterium paratuberculosis en raison des nombreuses réactions croisées avec les autres espèces mycobactériennes.
Nous avons analysés, dans ce travail, les protéines antigéniques de Mycobacterium paratuberculosis afin d’y mettre en évidence des constituants intéressants pour la mise au point d’un test sérologiques spécifiques et sensible pour la paratuberculose bovine. Une quarantaine de protéines, situées dans une région allant de 18 à 75 KDa, ont été identifiées à l’aide d’un sérum de lapin hyperimmunisé contre Mycobacterium paratuberculosis : les composants les plus antigéniques sont situés dans la région allant de 25 à 40 KDa. Des résultats analogues ont été obtenus à l’aide de sérums de bovins paratuberculeux. La région allant de 25 à 40 KDa est particulièrement bien reconnus par les sérums d’animaux paratuberculeux et cela à différents stades de la maladie.
Nous avons montré que toutes les protéines, d’un poids moléculaire supérieur à 40 KDa, reconnues par les bovins paratuberculeux possèdent des épitopes communs avec Escherichia Coli et que la plupart des protéines antigéniques de Mycobacterium paratuberculosis possèdent des épitopes communs avec Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis et Mycobacterium phlei. Seule une protéine de 18 KDa semble être entièrement spécifique à Mycobacterium paratuberculosis.
Comme la croissance de Mycobacterium paratuberculosis est lente, la purification des protéines antigéniques que nous avons identifiées est difficilement réalisable à partir de culture de la bactérie. Elles ont, de ce fait, été produites par génie génétique. Nous avons caractérisé neuf polypeptides recombinants antigéniques de Mycobacterium paratuberculosis isolés préalablement à ce travail après criblage d’une banque génomique de Mycobacterium paratuberculosis dans le vecteur λgt11. Nous avons déterminé leurs tailles et montrés que trois d’entre eux (A361, A362 et A363) correspondant à une protéine de 34 KDa du complexe antigénique A36. Les autres (A2, A4, A5, A6 et A7) correspondent à des protéines ne faisant pas partie de ce complexe. Les polypeptides recombinants A4 et A6 semblent être constitués uniquement d’épitopes conformationnels. Les polypeptides mycobactéries produits par les phages A2 et A362 sont spécifiques à Mycobacterium paratuberculosis vis-à-vis des autres espèces mycobactériennes et sont bien reconnus par des sérums de bovins paratuberculeux. Finalement, nous avons réalisé les premières étapes de mise au point d’un test ELISA spécifique pour la paratuberculose bovine à l’aide du polypeptide recombinant A362.

Paratuberculosis --- Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis --- Immunologic Techniques --- Medical Laboratory Science

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Le bactériophage 2C, phage lytique de Bacilius subtilis, possède un génome constitué d’une molécule d’ADN linéaire double brin d’une taille de 150.000 paires de bases où la thymine est entièrement remplacée par une base anormale : l’hydroxyméthyluracile.
Ce travail vise à étudier le mode de réplication du génome viral. A cette fin, deux voies différentes ont été utilisées : la caractérisation de mutants thermosensibles permettant de sélectionner les mutants de réplication et l’isolement par clonage d’éléments auto réplicatifs viraux.
Des mutants thermosensibles du virus 2C ont été isolés, puis caractérisés par trois techniques différentes :
une méthode fluorimétrique, la biosynthèse d’ADN en présence d’uridine marquée et la biosynthèse d’ADN dans des cellules perméabilisées.
La spectrofluorimétrie a permis de mesurer in vivo la quantité d’ADN présent dans des cellules infectées, en utilisant deux fluorochromes qui ont un comportement différent vis-à-vis des ADN bactériens et viraux en fonction de la composition en base de ceux-ci et de la présence de la base anormale dans le génome viral. Cette méthode a permis de regrouper les mutants du phage 2C en trois grandes familles d’après les fonctions qui seraient affectées :
- synthèse ou incorporation de la base anormale
- réplication de l’ADN viral
- absence d’inhibition de la synthèse de l’ADN bactérien ou réplication ralentie de l’ADN viral.
Pour quelques mutants caractéristiques de chaque famille ainsi définie, nous avons mesuré la biosynthèse de l’ADN viral en présence d’uridine marqué au tritium, dans une souche déficiente dans le système de réparation de l’ADN (rec E4) de B. subtilis, après perturbation du système réplicatif bactérien par les rayons ultra-violets. Cette méthode regroupe les mutants en deux classes :
1. synthèse normale de l’ADN viral
2. réplication ralentie.
Ces données permettent de supposer que le virus 2C peut utiliser certaines fonctions bactériennes pour assurer la réplication de son génome.
La caractérisation par ultracentrifugation isopycnique et par hybridation de l’ADN synthétisé dans des cellules infectées rendues perméables a permis de confirmer les fonctions affectées pour quelques mutants. L’un de ceux-ci serait affecté dans l’inhibition de la synthèse de l’ADN bactérien, un autre dans la biosynthèse de la base anormale ou dans son incorporation dans l’ADN viral.
En utilisant la technique de clonage, nous avons permis à un plasmide (pCM3) ne se répliquant pas initialement dans B. subtilis, de se répliquer dans cet hôte grâce à l’insertion d’un fragment d’ADN provenant du virus 2C. Ceci laisserait supposer que ‘l’origine de réplication virale peut-être reconnue par le système réplicatif bactérien et que l’initiation de la réplication du génome viral peut se dérouler en absence de la base anormale

Bacteriophages --- Replica Techniques --- Bacillus subtilis --- Cloning, Molecular