Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Spanningsafhankelijke Na+ kanalen zijn proteïne-complexen ingebed in biologische celmembranen. Ze spelen een cruciale rol in de regulatie van de membraan potentiaal, in het ontstaan en de propagatie van de actiepotentiaal in de meeste elektrische exciteerbare cellen. Hun fysiologisch belang bij vertebraten wordt in de verf gezet door het feit dat mutaties aanleiding kunnen geven tot levensbedreigende ziekten. Bovendien zijn deze kanalen ook een doelwit voor verscheidene commercieel verkrijgbare geneesmiddelen. Studies hebben ook een belangrijke rol voor deze kanalen aangetoond bij insecten, namelijk hun belang bij het veroorzaken van resistentie tegen insecticiden. Doordat spanningsafhankelijke Na+ kanalen zo belangrijk zijn, vormen deze ook een belangrijk doelwit voor dierlijke venomen. Toxines van schorpioen-, conusslak-, spin- en insectvenomen zijn gebruikt om negen verschillende bindingsplaatsen te identificeren op deze kanalen. Elk van deze bindingsplaatsen veroorzaakt een effect op de Na+ stroom. Bijgevolg is de zoektocht naar nieuwe potente en selectieve toxines een lovenswaardig initiatief omdat ze nieuwe werktuigen kunnen zijn voor de opheldering van de individuele fysiologische rol van spanningsafhankelijke Na+ kanalen. Bovendien zijn de peptides van venomen geëvolueerd vanuit een relatief klein aantal structuren dewelke een groot arsenaal aan farmacologische effecten kunnen teweeg brengen. Daardoor zijn deze peptides uniek geplaatst om als basis te dienen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en insecticiden. Ten slotte kunnen structuur-functie studies van toxines met betrekking tot spanningsafhankelijke Na+ kanalen een nieuw licht werpen op de structurele kenmerken en het werkingsmechanisme van deze kanalen. Het doel van deze studie was tweeledig. Enerzijds hebben we een antwoord proberen te geven op de vraag: Hoe en waarom beïnvloedt een toxine zijn doelwit en wat kunnen we doen om dit proces te beïnvloeden? In Hoofdstuk 1 hebben we de geconserveerde aromatische aminozuren in lange-keten schorpioen toxines (BmK M1 als model: Y5, Y14, Y21, W35, W38, Y42 en W47) met behulp van mutagenese bestudeerd. Onze resultaten vertonen een opvallende relatie tussen de LD50 waarden opmuizen en EC50 waarden op Nav1.5 en duiden op een belangrijke, specifieke rol voor deze aminozuren. De aromatische zijketens van Y5, Y35 en W47 lijken onontbeerlijk te zijn voor de structuur en dus de functie van het bestudeerde toxine, BmK M1. Aminozuren W38 en Y42 zijn naar alle waarschijnlijkheid betrokken in de farmacologische functie van het toxine. In Hoofdstuk 2 hebben we de rol bestudeerd van 14 N- en C-terminale residuen in BmK M1 door ze te muteren naar één of meerdere andere aminozuren. We zijn er in geslaagd om de ‘α-like’ eigenschappen van BmK M1 (actief op zowel zoogdieren als insecten) te heroriënteren naar een veel hogere zoogdierspecificiteit of zelfs volledige insectspecificiteit. Bijgevolg draagt deze studie aanzienlijk bij tot de opheldering en in kaart brengen van de (drie) epitopen die verantwoordelijk zijn voor de speciesselectiviteit van schorpioen ‘α-like’ toxines. In Hoofdstuk 3 zijn we dieper ingegaan op deze epitopen door 6residuën te analyseren met behulp van mutagenese dewelke gelegen zijn in de ‘vijf-residue omgekeerde lus’ (residuen 8-12) en de C-terminus van BmK M1. Als gevolg beschrijven we hier het bestaan van een moleculaire schakel op positie 8 (een lysine). Op deze plaats kan de substitutie met specifieke residuen resulteren in een volledige selectiviteit voor zoogdieren ofwel voor insecten. Gedetailleerde structurele analyse met behulp van X-stralen diffractie heeft hier een uniek structureel mechanisme onthuld dat verantwoordelijk is voor dit fenomeen. Onze resultaten wijzen ook op de belangrijke rol met betrekking tot fylogenetische specificiteit van BmK M1 voor de residuen aanwezig in een hydrofobe ‘hechtstrip’ rond residu 58. Anderzijds zijn we op ontdekkingstocht geweest tussen venomen van verschillende organismen (schorpioenen, spinnen, zeeanemonen, kikkers) om nieuwe, selectieve en potente liganden te vinden voor spanningsafhankelijke Na+ kanalen. In Hoofdstuk 4 beschrijven we vier nieuwe toxines voor dit doelwit. Deze toxines zijn opgezuiverd uit het venoom van 2 spinnen: Ceratotoxins 1, 2 en 3 van Ceratogyrus cornuatus en phrixotoxin 3 van Phrixotrichus auratus. De farmacologische profielen van deze toxines zijn uitgebreid getest op 6 gecloneerde spanningsafhankelijke Na+ kanalen (Nav1.1/β1, Nav1.2/β1, Nav1.3/β1, Nav1.4/β1, Nav1.5/β1, and Nav1.8/β1). Phrixotoxin 3 is één van de meest potente toxines voor spanningsafhankelijke Na+ kanalen beschreven tot nu toe. Vooral Nav1.2/β1 is gevoelig met een IC50 waarde van rond de nanomolair. Ceratotoxins 1 en 2 zijn ook potente modulatoren van de neuronale spanningsafhankelijke Na+ kanalen. Alhoewel ze slechts één aminozuur verschillen is ceratotoxin 2 de enige die Nav1.3/β1 moduleert. Bijgevolg zijn phrixotoxin 3, ceratotoxin 1 en 2 bijzonder geschikt als werktuigen om een onderscheid te maken tussen de drie types van spanningsafhankelijke Na+ kanalen die voorkomen in het centrale zenuwstelsel. Ceratotoxin 3 is selectief voor TTX-r spanningsafhankelijke Na+ kanalen wanneer deze wordt gebruikt bij micromolaire concentraties. Hierbij vermeldt dit hoofdstuk ook de eerste grondige evolutionaire analyse van deze en andere structureel verwante spinnentoxines. Deze resultaten bevatten belangrijke aanwijzingen voor toekomstig structuur-functie onderzoek. In Hoofdstuk 5 hebben we LqqIT2, een onderdrukkend neurotoxine van de schorpioen Leiurus quinquestriatus quinquestriatus, grondig bestudeerd. Het meest interessante aspect van dit toxine is zijn volledige insect-specificiteit. Bij een concentratie van 1 µM werd het insect spanningsafhankelijke Na+ kanaal, para/tipE, grondig gemoduleerd terwijl zijn tegenhanger bij de vertebraten, Nav1.2/β1, niet beïnvloed werd. Dit kenmerk biedt interessante perspectieven voor de ontwikkeling van nieuwe, selectieve insecticiden. In Hoofdstuk 6 hebben we twee toxines van de zeeanemoon Bunodosoma granulifera, BgII en BgIII, onderworpen aan een electrophysiologische vergelijking tussen 5 gekloneerde spanningsafhankelijke Na+ kanalen. Onze data tonen aan dat BgII vooral actief is op het insect spanningsafhankelijke Na+ kanaal met een EC50 waarde van 5.5 ± 0.5 nM. Gebaseerd op onze data bediscussiëren we ook een evolutionaire link tussen crustaceeën en insecten. In Hoofdstuk 7 bestuderen we batrachotoxin, een potente modulator van spanningsafhankelijke Na+ kanalen. Batrachotoxine, één van de meest gevaarlijke en dodelijke toxines op aarde is aanwezig in huidsecreties van verschillende pijlgifkikkers in Zuid-Amerika en sommige vogelsoorten in Nieuw-Guinea. Van oudshergebruiken indianen in Zuid- en Centraal Amerika dit toxine in combinatie met blaaspijppijltjes om te jagen. Gedurende de laatste 30 jaar is batrachotoxine het onderwerp geweest van wetenschappelijk onderzoek, militaire exploitatie en bioterrorisme. Sinds zijn ontdekking, hebben veldbiologen een gevoel van voosheid beschreven wanneer delen van hun lichaam in contact kwamen met batrachotoxine. Tot op heden was dit symptoom en fenomeen onverklaarbaar. In deze studie beschrijven we de ingrijpende, modulerende werking van batrachotoxine op Nav1.8, waarmee niet alleen de voosheid kan verklaard worden maar mogelijk een weg naar een nieuwe generatie pijnstillers ontdekt is. Immers, dankzij recent onderzoek (o.a. met zogenaamde knock-out muizen) blijken Nav1.8 kanalen bijzonder belange spelers te zijn in de signaal-transductie van onze pijnsensatie in het perifere zenuwstelsel. Het onderbreken van deze signaal-transductie door een ingrijpende modulatie van Nav1.8 heeft tot gevolg dat er geen actiepotentialen meer plaatsvinden in de perifere neuronen en aldus geen pijnsensatie meer gevoeld wordt. Voltage-gated Na+ channels (VGSCs) are cell membrane-spanning protein complexes which play a pivotal role in the regulation of membrane voltage and in the generation and propagation of action potentials in most electrically excitable cells. In vertebrates, their physiological importance is emphasized by a large number of life-threatening diseases caused by channel mutations. Furthermore, these critical channels are also targeted by a number of commercially available drugs. In invertebrates, studies have shown that insect VGSCs are directly related to the phenomenon of insecticide resistance. Being this important, VGSCs are one of the foremost targets of animal venoms. Toxins from scorpion, sea anemone, cone snail, spider and insect venom have been used to describe nine different receptor sites, all of which are linked to specific effects on channel function. As a consequence, the search for novel potent toxins with distinct preferential selectivity is laudable because they can provide novel tools for the elucidation of the individual physiological role of VGSCs. In addition, venom peptides have evolved from a relatively small number of structural frameworks but nevertheless posses a huge arsenal of pharmacological effects. This property makes them a unique source of leads and structural templates from which new therapeutic agents might be developed. Toxins might also replace the classical chemical insecticides used for crop protection, animal health or the control of insects that endanger human health. Finally, studies on the structure-function relationships of toxins towards their targets have already shed light on the structural features of their channel binding site and can serve a better understanding of the working mechanism of VGSCs from vertebrates and invertebrates. The principal objectives of this study were twofold. First, we tried to give an answer to the question: Why and how does a toxin influence its target and what can we do to influence this process? In Chapter 1 we studied the role of the aromatic amino acid residues conserved in all scorpion long-chain VGSC toxins. An effective yeast expression system was used to study the role of seven conserved aromatic residues (Y5, Y14, Y21, Y35, W38, Y42 and W47) from the scorpion toxin BmK M1. Our results show an eye-catching correlation between the LD50 values on mice and the EC50 values on Nav1.5 in oocytes, indicating large mutant-dependent differences that emphasize important specific roles for the conserved aromatic residues in BmK M1. The aromatic side-chains of the Y5, Y35 and W47 cluster protruding from the three-stranded β-sheet, seems to be essential for the structure and function of the toxin. Residues W38 and Y42, respectively located in β2 and in the loop between β2 and β3 are most likely involved in the pharmacological function of the toxin. In Chapter 2 we studied the role of 14 N- and C-terminal residues from BmK M1. Using site-directed mutagenesis, all of these residues were individually substituted by one or more amino acids, resulting in a total of 19 mutants. By mutating single amino acids we were able to redirect the α-like characteristics of BmK M1 (active on both mammals and insects) to either much higher mammal specificity or, in a few cases, total insect specificity. This study therefore represents a thorough mapping and elucidation of three epitopes that underlie the molecular basis of the mammalian and insecticidal potency of BmK M1 on VGSCs. In Chapter 3 we thoroughly dissected the role of 6 critical residues located in the five-residue reverse turn (8-12) and C-tail of BmK M1. The aforementioned residues were individually substituted by oneor more amino acids, resulting in a total of 11 mutants. As a result, we describe the existence of a molecular switch at position 8 (a lysine), where the substitution with specific residues can redirect the α-like characteristics of BmK M1to either total insect specificity or much higher mammal specificity. Detailed structural analysis reveals a unique structural mechanism by which the distinct conformational state favouring insect or mammal-selectivity could be achieved. Our results also show the specific role of the residues present in a hydrophobic “gasket” surrounding residue 58 with respect to the phylogenetic preference of the toxin. Secondly, we explored venoms from diverse organisms including scorpions, spiders,sea anemones and frogs in order to find novel, selective and potent ligands for VGSCs. In Chapter 4 we describe four novel peptide toxins which act on VGSCs which we isolated from two tarantula venoms: Ceratotoxins 1, 2 and 3 (CcoTx1, CcoTx2, and CcoTx3) from Ceratogyrus cornuatus and phrixotoxin 3 (PaurTx3) from Phrixotrichus auratus . The pharmacological profiles of these new toxins were extensively characterized by electrophysiological measurements on six cloned VGSCs expressed in Xenopus laevis oocytes (Nav1.1/β1, Nav1.2/β1, Nav1.3/β1, Nav1.4/β1, Nav1.5/β1, and Nav1.8/β1). PaurTx3 is one of the most potent peptide modulators of VGSCs described thus far from spider venom modulating especially Nav1.2 with an IC50 value in the nanomolar range. CcoTx1 and CcoTx2, differing by only one amino acid are also potent modulators of voltage-gated Na+ channel subtypes in the central nervous system except for Nav1.3 which is only modulated by CcoTx2. As a consequence, CcoTx1, CcoTx2 and PaurTx3 can be used as powerful tools to discriminate the three voltage-gated Na+ channel subtypes present in central nervous system neurons (Nav1.1, Nav1.2 and Nav1.3) and study their involvement in neuropathologies. CcoTx3 is selective for a tetrodotoxin-resistant channel subtype when applied in the micromolar range. In addition to these results, this paper reports the first thorough evolutionary trace analysis of these and other structurally related three-disulfide spider toxins, providing important clues for toxin-channel interaction and future structure-function research. In Chapter 5 we thoroughly studied LqqIT2, a depressant neurotoxin present in the venom of the Leiurus quinquestriatus quinquestriatus scorpion. The most interesting feature of LqqIT2 is its total insect-selectivity. At a concentration of 1 µM, the insect-VGSC, para, was profoundly modulated while its mammalian counterpart, the rat brain Nav1.2 channel, was not affected. This trait offers excellent prospects for the development of novel insecticides. In Chapter 6 we subjected two toxins, BgII and BgIII, isolated from the sea anemone Bunodosoma granulifera, to an electrophysiological and pharmacological comparison between 5 different cloned VGSC. Our data show that BgII, generally known as a neurotoxin, is especially potent on the insect Na+ channel with an EC50 value of 5.5 ± 0.5 nM. Therefore, this toxin can be used as a template for further development of new insecticides. Based on our findings, an evolutionary relationship between crustaceans and insects is also discussed. Finally, in Chapter 7 we studied batrachotoxin, a potent modulator of VGSCs. Since its discovery, field researchers reported numbness after their skin came into contact with this toxin. Intrigued by this phenomenon, we determined the effect of batrachotoxin on the VGSC Nav1.8, which is considered to be a key player in nociception. As a result, we discovered that batrachotoxin profoundly modulates this channel: the inactivation process is severely altered, the voltage-dependence of activation is shifted towards more hyperpolarized potentials resulting in the opening of Nav1.8 at more negative membrane potentials and the ion selectivity is modified.