TY - THES ID - 145440728 TI - Assessment of the growth of Listeria monocytogenes in Belgian artisanal cheeses and investigations on factors governing it AU - Gérard, Amaury AU - Sindic-Frère, Marianne AU - Daube, Georges PY - 2021 DB - UniCat UR - https://www.unicat.be/uniCat?func=search&query=sysid:145440728 AB - Fournir des aliments sûrs aux consommateurs reste un défi clé de nos jours, avec la volonté de favoriser les produits naturels et les denrées alimentaires exemptes d'additifs. Parmi les maladies d'origine alimentaire, la listériose est la cinquième plus importante dans l'Union Européenne en termes d'occurrence, avec plus de2.500 cas rapportés en 2018. Listeria monocytogenes, le pathogène responsable de cette maladie, peut être transmis par diverses denrées alimentaires prêtes à être consommées, notamment les produits laitiers. En tant que vecteurs potentiels de L. monocytogenes, les fromages doivent satisfaire aux critères microbiologiques définis dans le Règlement (CE) N° 2073/2005. Par défaut, les fromages sont considérés comme des denrées alimentaires prêtes à être consommées permettant la croissance du pathogène au cours de leur durée de vie. En conséquence, les producteurs doivent garantir la non-détection de L. monocytogenes au sein de leurs fromages avant leur mise sur le marché. Cependant, diverses études étrangères ont permis d'identifier des variétés de fromages ne permettant pas cette croissance, et assurant même parfois une baisse des niveaux de contamination durant le stockage. Les fromages belges, en particulier les produits artisanaux, sont relativement inconnus, bien que ce pays possède une riche diversité de variétés de fromage et de producteurs. Ainsi, peu de données sont disponibles en ce qui concerne le comportement de L. monocytogenes dans ces aliments. Les variétés belges de fromage sont donc considérées comme des aliments permettant la croissance de L. monocytogenes en cours de stockage réfrigéré. Bien que nécessaires pour garantir la sécurité des consommateurs, les critères d'hygiène des denrées alimentaires constituent une épée de Damoclès permanente au-dessus de la tête des producteurs. La détection de L. monocytogenes peut en effet engendrer de graves conséquences économiques et morales. L'objectif principal de cette thèse de doctorat a donc été d'évaluer la croissance de L. monocytogenes dans différentes variétés artisanales de fromages belges, et de comprendre les principaux facteurs l'influençant. Premièrement, une enquête téléphonique a été réalisée auprès de 142 producteurs belges de fromage artisanal, fournissant des connaissances générales sur les producteurs, les procédés de fabrication et les variétés. Globalement, 16 grands types de fromage ont été identifiés. Un tiers des variétés correspondaient à des pâtes lactiques fraîches. Un autre tiers était constitué par les fromages à pâte pressée non cuite, incluant les types Saint-Paulin et Gouda, principalement retrouvés en Wallonie et en Flandre, respectivement. Les pâtes molles représentaient près de18 % des variétés identifiées lors de l'enquête. Enfin, des variétés mineures ont également été répertoriées, incluant les pâtes pressées mi-cuites et cuites, les bleus, la Ricotta, la Mozzarella, le Halloumi et la Feta. Sur base des ces données, 65 variétés ont été sélectionnées pour une caractérisation plus approfondie. Ainsi, les fromageries concernées ont été visitées et les procédés de fabrication ont été suivis. Enfin, des échantillons de produits finis ont été prélevés pour être caractérisés physico-chimiquement. Parmi ces 65 variétés fromagères, seules deux présentaient des caractéristiques physico-chimiques permettant naturellement une inhibition de la croissance de L. monocytogenes, i.e. un pH ≤ 4,4, ou une aw ≤ 0,92, ou enfin un pH ≤ 5,0 et une aw ≤ 0,94. Cela signifie donc que la majorité des variétés permettent théoriquement la croissance du pathogène, confirmant l'intérêt de la présente thèse. Les données collectées n'ont pas permis d'améliorer les outils de classification des fromages actuellement disponibles. Après cela, 32 variétés représentatives de la diversité des fromages artisanaux belges ont été sélectionnées en vue d'évaluer la croissance de L. monocytogenes en leur sein. Il a été décidé de réaliser des tests de provocation à cette fin, impliquant une contamination artificielle des fromages par L. monocytogenes. Brièvement, trois lots de chaque variété ont été étudiés, à l'exception des variétés pour lesquelles les outils informatiques de prédiction de croissance avaient au préalable démontré l'impossibilité pour le pathogène de s'y développer. Pour chaque lot, 12 pièces ont été prélevées. Six ont été artificiellement inoculées, les autres servant de témoins. L. monocytogenes a été dénombrée les premier et derniers jours de stockage à8 ± 1 °C, permettant de déterminer le potentiel de croissance du pathogène pour chaque lot. Il a été conclu que les pâtes lactiques fraîches permettaient systématiquement une décroissance des niveaux de contamination par L. monocytogenes. Par le biais d'une nouvelle circulaire, ce type de fromage est maintenant reconnu comme sûr pour la santé humaine par l'Agence Fédérale pour la Sécurité de la Chaîne Alimentaire. Un niveau maximal de 100 ufc/g de L. monocytogenes est maintenant toléré pour ces produits. Les résultats relatifs aux autres types de fromages ont été plus controversés. Globalement, les fromages à pâte molle ont permis la croissance du pathogène jusqu'à des niveaux dangereux. Néanmoins, trois lots d'un Herve au lait cru ont présenté une décroissance des niveaux de contamination. Concernant les fromages à pâte mi-dure, une grande variabilité a été observée entre variétés, entre lots et entre pièces. Les paramètres physico-chimiques et les données associées aux procédés de fabrication n'ont pas permis de comprendre ces différences. Il a été choquant de constater que les méthodologies actuellement détaillées par le Laboratoire de Référence de l'Union européenne pour L. monocytogenes ne permettaient pas de tenir compte de cette variabilité en déterminant les risques liés à une denrée. Une révision de ces méthodes devrait être à l'ordre du jour afin de garantir de façon efficace la sécurité des consommateurs. Il a été décidé de s'intéresser au microbiote des fromages, en vue d'identifier des espèces bactériennes ou des consortia pouvant potentiellement inhiber L. monocytogenes. Au moyen des nouvelles technologies de séquençage, la richesse et la diversité bactérienne ont été déterminées au niveau du genre. Ces deux paramètres étaient significativement plus élevés au sein des fromages à pâte molle en comparaison aux autres types. De façon surprenante, la diversité bactérienne était très faible dans les fromages à pâte mi-dure, et l'étude du microbiote n'a pas permis de formuler des hypothèses intéressantes expliquant la variabilité observée pour ces produits. En ce qui concerne le Herve, la métagénétique a révélé la présence d'une bactérie inconnue appartenant au genre Fusobacterium, avec une abondance relative de l'ordre de 10 %.Une hypothèse a été de se dire que la présence de cette bactérie pourrait expliquer les observations surprenantes réalisées précédemment, concernant la décroissance des niveaux de L. monocytogenes lors du stockage de ces produits. Néanmoins, nous ne sommes pas parvenus à isoler la bactérie concernée. La métagénomique appliquée sur les extraits d'ADN obtenus à partir du fromage a permis d'assembler et d'annoter le génome théorique de cette bactérie. L'identité nucléotidique et l'arbre phylogénomique ont suggéré qu'elle pourrait appartenir à une nouvelle espèce du genre Fusobacterium. La comparaison de protéomes a permis d'identifier des familles protéiques, voies métaboliques et sous-systèmes potentiellement non partagés avec d'autres espèces de Fusobacterium. Néanmoins, sans être parvenu à isoler la bactérie, il demeure impossible de décrire la nouvelle espèce, ainsi que d'évaluer son rôle potentiel dans l'inhibition observée de L. monocytogenes au sein de ce fromage de Herve. Globalement, bien que des marqueurs aient pu être identifiés pour les pâtes lactiques fraîches, il n'a pas été possible de déterminer des facteurs individuels pouvant affecter la croissance ou l'absence de croissance de L. monocytogenes au sein des fromages à pâte mi-dure. Il est possible que son comportement soit plutôt affecté par l'interaction complexe entre différents facteurs intrinsèques à chaque variété de fromage et permettant ainsi de fournir une barrière suffisante à la croissance du pathogène. Cette thèse a contribué à la connaissance globale relative aux fromages artisanaux belges, en lien avec L. monocytogenes, mais pas mal de pistes peuvent encore être explorées durant les prochaines années, concernant la recherche fondamentale mais aussi le développement de lignes directrices et normes universelles plus appropriées. ER -