TY - THES ID - 138800910 TI - Optimalisatie van monstervoorbereiding in hogedoorvoer proteoomanalyses met behulp van massaspectrometrie AU - Dufour, Sara AU - Therry, M. AU - Odisee PY - 2017 PB - Gent Odisee DB - UniCat UR - https://www.unicat.be/uniCat?func=search&query=sysid:138800910 AB - Proteoomanalyse is de studie van het proteoom. Hierbij worden de structuur en functies van proteïnen onderzocht. Het proteoom is de verzameling van alle proteïnen die in een organisme tot expressie komen. In deze bachelorproef werden verschillende protocollen vergeleken voor de monstervoorbereiding van proteoomanalyses aan de hand van massaspectrometrie. Deze protocollen zijn door de jaren heen in gebruik genomen door de VIB Proteomics Core en verschillen in de lyse- en extractiemethode om de beoogde proteïnen uit biologisch materiaal te isoleren. De vergeleken protocollen lyseren cellen op basis van chaotropen zoals ureum en guanidinium hydrochloride, detergenten zoals CHAPS en Amphipols, vriesdooi cylci of op basis van een commerciële kit van de firma PreOmics. Elk van deze protocollen werd gebruikt voor een proteoomanalyse van humane HEK 293T cellen. Bij elk lyseprotocol werd geëvalueerd hoeveel proteïnen geïdentificeerd werden, van welke cellulaire compartimenten deze proteïnen afkomstig waren en wat de aanwezigheid was van gewenste, toegelaten en ongewenste eiwitmodificaties. Ook de efficiëntie van eiwitverknipping tijdens de monstervoorbereiding door de proteolytische enzymen endoLysC en trypsine werd geëvalueerd aan de hand van het aantal missed cleavages die werden teruggevonden in de geïdentificeerde peptiden. Ondanks kleine verschillen tussen de protocollen vertoonden alle procedures verwachtte aantallen gewenste, aanvaarde en ongewenste eiwitmodificaties, met als noemenswaardige uitschieters een hoog percentage aan geoxideerde methionineresiduen in het PreOmics protocol en een hoog percentage aan eiwitcarbamylatie in het Ureum protocol. Eiwitverknipping door endoLysC en trypsine verliep efficiënt bij protocollen die gebruik maken van detergenten en vries-dooi cycli. Het standaardprotocol op basis van ureum behaalde hogere, maar nog steeds aanvaardbare percentages aan missed cleavages, in tegenstelling tot het protocol op basis van guanidinium hydrochloride waarbij slechts de helft van de peptiden geen missed cleavages bevatten. Doordat guanidinium hydrochloride een inert chaotroop is, en daarom ongevoelig voor schommelende reactiecondities, werd het veelbelovende guanidinium hydrochloride protocol verder geoptimaliseerd en versneld naar analogie met de commerciële PreOmics procedure. Tijdens een eerste optimalisatie-experiment werd een single pot extractie-, reductie- en alkylatieprocedure succesvol ontwikkeld. In een tweede optimalisatie-experiment werd volledige endoLysC verknipping bereikt in slechts 30 minuten door een verhoging van de enzymconcentratie bij een optimale temperatuur. Gelijkaardige optimale condities voor snelle verknipping door trypsine konden niet worden achterhaald en vormen het onderwerp van verder onderzoek aan de VIB Proteomics Core met als doel om de volledige monstervoorbereidingsprocedure verder in te korten tot een procedure van een 4 à 5 uur. ER -