TY - THES ID - 135623647 TI - Gerichte integratie van transgenen via homologe recombinatie : Generatie van stabiele cellijnen via Flp-lnTM technologie AU - Parmentier, Emiel AU - Van Houdt, L. AU - Odisee PY - 2015 PB - Gent Odisee DB - UniCat UR - https://www.unicat.be/uniCat?func=search&query=sysid:135623647 AB - Transfecties worden uitgevoerd om cellen recombinante eiwitten tot expressie te laten brengen.Als bij de transfectie het vreemde DNA willekeurig geïntegreerd wordt in het genoom van de cel zullen heterogene populaties gevormd worden. Plaatsspecifieke integratie via homologe recombinatie van dit vreemde DNA zal isogene populaties als gevolg hebben. Flp-In™ technologie omvat cellijnen en plasmiden waar in beide een FRT (Flippase Recognition Target) sequentie aanwezig is. Deze FRT sequentie is aanwezig op een specifieke locatie in het genoom. Homologe recombinatie vindt plaats ter hoogte van deze FRT sequenties mbv het flp recombinase enzyme waardoor het expressie plasmide specifiek geïntegreerd wordt ter hoogte van de genomische FRT sequentie. Zo ontstaat een isogene celpopulatie. Het CBS team binnen Ablynx heeft verschillende HEK293H Flp-In™ cellijnen gegenereerd met een FRT sequentie op telkens andere plaatsen in het genoom. De transcriptionele activiteit werd gemeten aan de hand van een reportergen (hOX40L).In dit eindwerk werden zes HEK293H Flp-In™ cellijnen (met verschillende hOX40L expressieniveaus) samen met een commerciële HEK293 Flp-In™ cellijn gekarakteriseerd.Transfectie efficiëntie en expressieniveaus van verschillende recombinante eiwitten werden vergeleken. De tijd nodig om foci te bekomen na transfectie en het aantal foci waren een maat om de transfectie efficiëntie te evalueren. De expressie van de recombinante eiwitten werd bepaald met Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Zoals verwacht vertoonde, na de experimenten, de commerciële HEK293 Flp-In™ cellijn gemiddeld de hoogste expressie van het doelwit eiwit. Twee HEK293H Flp-In™ high cellijnen werden niet bevonden als geschikte vervanging voor de commerciële HEK293 Flp-In™ cellijn wegens lagere transfectie efficiëntie en lage expressie van het doelwit eiwit. Twee HEK293H Flp-In™ low cellijnen werden wel als geschikt bevonden voor verder gebruik, zij vertoonden hoge transfectie efficiëntie en lage expressie van het doelwit eiwit. ER -