TY - BOOK ID - 127262660 TI - Clonage du gène P1A d'un variant de perte du mastocytome murin P815 AU - Sorel, Marie-Christine AU - Boon, Thierry AU - UCL.. MD/MIGE/GECE - Unité de génétique cellulaire PY - 1991 PB - Bruxelles: UCL, DB - UniCat KW - T-Lymphocytes, Cytotoxic KW - Cloning, Molecular KW - Medical Laboratory Science KW - tumor rejection antigen P815A, mouse UR - https://www.unicat.be/uniCat?func=search&query=sysid:127262660 AB - Le gène P1A est un gène codant pour un antigène de rejet tumoral majeur du mastocytome P815 de souris.<BR>Le clone tumoral P1, dérivé de la tumeur P815, exprime 4 antigènes si—distincts qui sont reconnus par des clones de lymphocytes T cytolytique de souris DBA/2 syngéniques. Ces antigènes ont été appelés A, B, C et D. Parmi ceux-ci, les antigènes A et B jouent un rôle essentiel dans la réponse immunitaire de rejet du mastocytome P815, observée in vivo. En effet, ces antigènes ont été perdus par plusieurs variants obtenus dans des souris qui avaient partiellement rejeté la tumeur. Ces variants appelés « variants de perte » ont donc échappé au rejet immunitaire de la tumeur.<BR>Le gène P1A, d’environ 5 kb et composé de trois exons, code pour une protéine putative de 224 acides aminés. Un fragment Smal-Xbal de 900 pb s’est révélé capable de conférer l’expression des antigènes A et B, après transfection dans une cellule récipiente A-B-. L’exon 1, qui code pour la plus grande partie de la protéine, est entièrement contenu dans ce fragment.<BR> Dans le cadre de l’analyse du gène P1A, nous avons entrepris d’identifier la région du gène codant pur le peptide antigénique P1A. Pour cela, nous nous sommes proposés d’analyser l’homologue du gène P1A porté par le variant de perte P1.213 (a+B+). Nous avons donc cloné le gène P1A porté par ce variant afin de séquencer le premier exon et de pouvoir comparer sa séquence à la séquence décrite dans P1.HTR (A+B+).<BR>Pour le clonage, nous avons eu recours à la construction d’une bibliothèque subgénomique d’ADN du variant A-B+ dans le phage lambda ZAP. Nous avons cloné dans ce vecteur un fragment EcoRI-EcoRI de 8 kb, contenant le gène P1A et provenant de l’ADN génomique de P1.213. En utilisant le fragment Smal-Xbal de 0,9 kb comme onde radioactive, nous avons screené la bibliothèque de phages lambda ZAP et nous avons ainsi obtenu 2 clones indépendants de phages lambda ZAP hébergeant le fragment EcoRI de 8 kb.<BR>Nous avons ressorti l’insert d’un de ces phages par excision in vivo, selon un protocole décrit, pour l’obtenir sous forme de plasmide. Nous avons transfectés l’ADN de ce plasmide dans une cellule A-B- et obtenu des tranfectants A-B+, comme c’était le cas dans la cellule de départ. Nous en avons sous-cloné l’exon 1 dans la phage M13, en vue du séquençage.<BR>Ceci nous a permis de mettre en évidence une mutation ponctuelle dans la région codante de l’exon 1. Cette mutation, une transition de T en C, modifie le 42ème résidu de la protéine qui, partant d’une Valine, devient ainsi une Alanine.<BR>Dans des expériences complémentaires, nous avons obtenu la preuve par mutagénèse que cette mutation était nécessaire et suffisante pour perdre le caractère antigénique A. Des peptides synthétiques correspondant à la version normale de la séquence environnant la mutation ont été préparés. L’un de ces peptides s’est avéré sensibiliser la cellule cible A-B- au CTL anti-A. Il s’agissait d’un peptide de 14 acides aminés, correspondant aux résidus N33-46C de la protéine putative. Comme attentu, la version mutée de ce peptide, a conféré la caractère antigénique B sans conférer l’expression de l’antigène A. ceci a donc également confirmé que la mutation était relevante.<BR>Nous avons, en outre, été surpris de constater que ces deux peptides sensibilisaient également la cellule cible A-B- au CTL anti-B. Ceci nous a permis de dire que les caractères antigéniques A et B, que l’on savait très liés sont conférés par un seul peptide antigénique et seraient donc dus à la présence de deux épitopes différents sur le même peptide antigénique. ER -