TY - BOOK ID - 127171761 TI - Étiopathogenèse des lymphoedèmes : criblage par séquençage à haut débit AU - Fastré, Élodie AU - Vikkula, Miikka AU - Brouillard, Pascal AU - UCL.. FASB - Faculté de pharmacie et des sciences biomédicales PY - 2013 PB - Bruxelles: UCL. Faculté de pharmacie et des sciences biomédicales, DB - UniCat KW - Lymphedema KW - High-Throughput Nucleotide Sequencing UR - https://www.unicat.be/uniCat?func=search&query=sysid:127171761 AB - Lymphedema, resulting from an accumulation of lymph in tissues, are characterized by chronic edema of the limbs due to defects of the lymphatic system. To date, mutations causing primary lymphedema have been found in eight genes: FLT4 (encoding VEGFR3), FOXC2, SOX18, CCBE1, GJC2, Gata2, PTPN14 and KIF11. We recently proposed a link between the encoded proteins, and around a central pathway, VEGFR3 signaling. However, more than 60% of familial cases and approximately 85 % of sporadic cases among 400 index cases in laboratory remain unexplained by mutations in these genes. We aim to identify new genes involved in primary lymphedema.In the first part of this Master thesis, GJC2, SOX18 and FOXC2 were screened by classical Sanger sequencing for some patients. Two heterozygous missense mutations, one of which is novel, were identified in GJC2. In the second part, we analyzed whole exomes of 42 patients sequenced by Next Generation Sequencing (NGS). Before seeking new mutated genes, the eight genes must be clearly excluded. It has been shown that exome capture covers effectively approximately 80% of exonic regions. Among the genes responsible for lymphedema, some are hardly covered. We identified missing regions in the eight genes, as well as in two genes being validated. We developed a series of multiplex PCRs to fill in the holes and applied this approach to 145 patients on the mini high-throughput sequencer, Personal Genome Machine (PGM, Ion Torrent). Despite several difficulties in establishing this technique, we obtained a good coverage for the missing regions by this method which is faster and with lower cost than classical Sanger sequencing exon by exon. In addition, by adding a few fragments to the multiplex PCRs, we were able to sequence fully five of the genes responsible of lymphedema in order to pre-screen them rapidly before sequencing their exomes. We demonstrate however the limits of this technology for sequencing of complexes genes such as GJC2, SOX18 and FOXC2. By identification, of 9 significant changes, probably mutations, our results confirm the efficacy of targeted high-throughput sequencing to screen known genes, and suggest to replace the large-scale screenings that were usually performed fragment by fragment by Sanger sequencing. Les lymphœdèmes, résultants d'une accumulation de lymphe dans les tissus, se caractérisent par un œdème chronique des membres suite à des défauts du système lymphatique. A ce jour, des mutations à l'origine de lymphœdèmes primaires ont été découvertes dans huit gènes : FLT4 (codant pour le VEGFR3), FOXC2, SOX18, CCBE1, GJC2, GATA2, PTPN14 et KIF11. Nous avons récemment proposé un lien entre les différentes protéines qu'ils codent, et autour d'une voie centrale, la signalisation du VEGFR3. Cependant, plus de 60% des cas familiaux et près de 85% des cas sporadiques parmi les 400 cas index du laboratoire restent inexpliqués. Nous visons à identifier de nouveaux gènes impliqués dans les lymphœdèmes primaires.Dans la première partie de ce mémoire, GJC2, SOX18 et FOXC2 ont été criblés par séquençage classique pour une partie des patients. Deux mutations faux sens hétérozygotes, dont une nouvelle, ont été identifiées dans GJC2. Avant de rechercher de nouveaux gènes mutés, les huit gènes connus doivent pouvoir être clairement exclus. Ainsi, parmi les gènes responsables de lymphœdème, certains ne sont quasiment pas couverts. Dans la deuxième partie, nous avons analysé des exomes de 42 patients séquencés par Next Generation Sequencing (NGS). Il a été montré que la capture d'exome ne couvre efficacement qu'approximativement 80% des régions exoniques. Ainsi parmi les gènes de lymphœdème, certains ne sont quasiment pas couverts. Nous avons répertorié les régions manquantes dans les huit gènes, ainsi que dans deux nouveaux gènes en cours de validation. Nous avons mis au point une série de PCR multiplexes pour combler ces trous et avons appliqué cette approche, pour 145 patients sur le mini séquenceur à haut débit, Persona/ Genome Machine (Ion Torrent). Malgré plusieurs difficultés rencontrées en établissant cette technique, nous avons obtenu une bonne couverture des régions manquantes par cette méthode plus rapide et à moindre coût que le séquençage de Sanger exon par exon. De plus, en ajoutant quelques fragments aux PCR multiplexes, nous parvenons à séquencer entièrement cinq des gènes responsables de lymphœdème dans le but de les pré-cribler rapidement avant de séquencer l'exome de patients. Nous démontrons cependant les limites de cette technologie pour le séquençage de gènes complexes tels que GJC2 , SOX18 et FOXC2. Par l'identification de 9 changements significatifs, probablement des mutations, nos résultats confirment l'efficacité de séquençage à haut débit ciblé pour le criblage des gènes connus, et suggèrent ainsi de remplacer les criblages à large échelle qui étaient habituellement réalisés fragment par fragment par Séquençage de Sanger. ER -