TY - BOOK ID - 126874616 TI - Caractérisation de mutants conditionnels du bactériophage 2C de B. subtilis et clonage de séquences autoréplicatives AU - Gillet, Philippe AU - Hoet, Philippe AU - UCL.. MD/MED/MIGE/GEMO - Unité de génétique moléculaire PY - 1990 PB - Bruxelles: UCL, DB - UniCat KW - Bacteriophages KW - Replica Techniques KW - Bacillus subtilis KW - Cloning, Molecular UR - https://www.unicat.be/uniCat?func=search&query=sysid:126874616 AB - Le bactériophage 2C, phage lytique de Bacilius subtilis, possède un génome constitué d’une molécule d’ADN linéaire double brin d’une taille de 150.000 paires de bases où la thymine est entièrement remplacée par une base anormale : l’hydroxyméthyluracile.<BR>Ce travail vise à étudier le mode de réplication du génome viral. A cette fin, deux voies différentes ont été utilisées : la caractérisation de mutants thermosensibles permettant de sélectionner les mutants de réplication et l’isolement par clonage d’éléments auto réplicatifs viraux.<BR>Des mutants thermosensibles du virus 2C ont été isolés, puis caractérisés par trois techniques différentes :<BR>une méthode fluorimétrique, la biosynthèse d’ADN en présence d’uridine marquée et la biosynthèse d’ADN dans des cellules perméabilisées.<BR>La spectrofluorimétrie a permis de mesurer in vivo la quantité d’ADN présent dans des cellules infectées, en utilisant deux fluorochromes qui ont un comportement différent vis-à-vis des ADN bactériens et viraux en fonction de la composition en base de ceux-ci et de la présence de la base anormale dans le génome viral. Cette méthode a permis de regrouper les mutants du phage 2C en trois grandes familles d’après les fonctions qui seraient affectées :<BR>- synthèse ou incorporation de la base anormale<BR>- réplication de l’ADN viral<BR>- absence d’inhibition de la synthèse de l’ADN bactérien ou réplication ralentie de l’ADN viral.<BR>Pour quelques mutants caractéristiques de chaque famille ainsi définie, nous avons mesuré la biosynthèse de l’ADN viral en présence d’uridine marqué au tritium, dans une souche déficiente dans le système de réparation de l’ADN (rec E4) de B. subtilis, après perturbation du système réplicatif bactérien par les rayons ultra-violets. Cette méthode regroupe les mutants en deux classes :<BR>1. synthèse normale de l’ADN viral<BR>2. réplication ralentie.<BR>Ces données permettent de supposer que le virus 2C peut utiliser certaines fonctions bactériennes pour assurer la réplication de son génome.<BR>La caractérisation par ultracentrifugation isopycnique et par hybridation de l’ADN synthétisé dans des cellules infectées rendues perméables a permis de confirmer les fonctions affectées pour quelques mutants. L’un de ceux-ci serait affecté dans l’inhibition de la synthèse de l’ADN bactérien, un autre dans la biosynthèse de la base anormale ou dans son incorporation dans l’ADN viral.<BR>En utilisant la technique de clonage, nous avons permis à un plasmide (pCM3) ne se répliquant pas initialement dans B. subtilis, de se répliquer dans cet hôte grâce à l’insertion d’un fragment d’ADN provenant du virus 2C. Ceci laisserait supposer que ‘l’origine de réplication virale peut-être reconnue par le système réplicatif bactérien et que l’initiation de la réplication du génome viral peut se dérouler en absence de la base anormale ER -