TY - BOOK ID - 126780133 TI - Mise au point de cellules transfectées permettant l'étude du clivage des précurseurs du peptide amyloïde AU - Coumans, Joëlle AU - Octave, Jean-Noël AU - UCL.. MD/NOPS/NCHM - Unité de neurochimie PY - 1991 PB - Bruxelles: UCL., DB - UniCat KW - Alzheimer Disease KW - Amyloid beta-Protein Precursor KW - Cloning, Molecular KW - Medical Laboratory Science UR - https://www.unicat.be/uniCat?func=search&query=sysid:126780133 AB - La maladie d’Alzheimer est une démence dégénérative caractérisée par des pertes neuronales et des lésions cérébrales telles que les dégénérescences neurofibrillaires et les plaques séniles. Au centre des plaques séniles se dépose une substance amyloïde dont le composant majeur est un peptide de 4,2 Kd : le peptide A4. Il dérive de différents précurseurs qui ressemblent à des protéines transmembranaires. Certains de ces précurseurs contiennent un domaine extracellulaire de séquence homologue aux inhibiteurs de protéases à sérine. <BR> Les ADNc correspondants à différents précurseurs du peptide amyloïde ont été cloné dans un vecteur quoi contient l’origine de réplication du virus SV40 : le plasmide pKCR3. Dans un premier temps, des cellules COS ont été transfectées en utilisant les ADNc clonés associés au DEAE-Dextran. 48 heures après la transfection, un anticorps monoclonal détecte les différents précurseurs du peptide amyloïde dans les cellules et leur milieu de culture. Lorsque ces précurseurs contiennent une séquence homologue aux inhibiteurs de protéases à sérine, ils sont capables d’inhiber la trypsine. <BR> Dans le but d’obtenir des transfectants stables exprimant les différents précurseurs du peptide amyloïde, des cellules CHO ont été transfectées en utilisant un précipité de phosphate de calcium contenant à la fois les ADNs clonés et un vecteur possédant un gène de résistance à la Néomycine : le plasmide pSV2Néo. Après une sélection des transfectants stables, par addition au milieu de culture de G418, l’expression des différents précurseurs du peptide amyloïde a été analysée dans les cellules et leur milieu de culture. Les cellules transfectées ont ensuite été soumises à des dilutions limites afin d’obtenir des lignées cellulaires clonales exprimant, tout comme dans le cas des transfectants transitoires, des protéines qui en fonction de leur séquence sont capables d’inhiber la trypsine. <BR> Après transfection du précurseur transmembranaire du peptide amyloïde, la protéine est détectée dans le milieu de culture des cellules transfectées. Cette protéine soluble résulte du clivage du précurseur transmembranaire. Des données récentes de la littérature semblent indiquer que ce clivage serait perturbé chez les patients atteints de la maladie d’Alzheimer. Le marquage métabolique des cellules transfectées à l’aide de méthionine S35 et l’immunoprécipitation des formes solubles du précurseur du peptide amyloïde va nous permettre d’étudier l’influence de différentes protéases et inhibiteurs de protéases sur le cinétique de clivage du précurseur du peptide amyloïde. ER -