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Primary lymphedema is a rare, genetically variable disorder. lt is characterized by chronic edema and usually affects the lower extremities. Primary lymphedema can be present at birth, develop around the time of puberty or appear after 35 years of age. Among the 563 index cases of the host laboratory, only 40 % is explained by mutations in one of the 20 genes acting around the VEGFR3 pathway, a key player in lymphangiogenesis. In the first part of this thesis, we screened a new candidate gene proposed by a collaborator. The inhibition of this gene by morpholinos decreased the expression of VEGFR3 in Zebrafish, leading to lymphedema. In total, 218 patients were screened. Six known polymorphisms were observed, but no damaging .mutation was detected. However, we cannot exclude a partial or total deletion of the gene, which is undetectable by direct sequencing. lt is also possible that mutations in this gene are extremely rare and therefore were absent in the tested series, or are too damaging and incompatible with lite. The second part of the thesis focused on the effects of 11 mutations identified in HGF. We generated expression vectors for six mutants and the wild-type human HGF. We transfected COS-7 cells and verified expression, stability and secretion of each mutant. Most of the mutant vectors seem to result in cellular HGf expression at a level similar to WT. However, the majority of the mutants are secreted at a lower level than WT. Considering that HGF acts in a dose-dependent manner, the small difference in secretion could influence the level of response of cells expressing the HGF receptor, c-MET. The ability of the mutants to bind to c-MET and activate the downstream signaling pathway is under investigation.The third part of this thesis was devoted to the study of 11variants identified in the TSC1 and TSC2 genes. Mutations in these genes are mainly responsible for tuberous sclerosis, which can sometimes be associated with lymphedema. ln order to investigate the effects of these 11 variants, we started a collaboration with the department of clinical genetics, Erasmus Medical Center in Rotterdam. They are experts in functional analysis of TSC1 and TSC2 variants. For this, we generated variants by site-directed mutagenesis.7 mutants have already been sent to Rotterdam and functional studies on the classic signaling pathway of 6 TSC2 mutants have been performed. The activity of TORC1 for each variant was estimated by calculating the ratio of phosphorylated SG kinase to total 56 kinase, as measured by immunoblotting. No major effect on the canonical pathway was observed. The interaction with other partners has to be explored in further detail. Le lymphœdème primaire est une pathologie rare, souvent d'origine génétique, caractérisée par un œdème chronique, majoritairement des membres inférieurs. Il peut être congénital, apparaître pendant la puberté ou se manifester après 35 ans. Parmi 563 cas index de laboratoire d'accueil, seulement 40 % sont expliqués par des mutations dans 20 gènes agissant autour de la voie du VEG FR3, un facteur clé de la lymphangiogenèse. La première partie de ce mémoire consistait à cribler un nouveau gène candidat identifié par un collaborateur. En effet, lorsque l'expression de ce gène était inhibée par des morpholinos, une diminution de l'expression du VEGFR3 était observée chez le Zebrafish, conduisant à un lymphœdème. Au total, 218 patients ont été criblés. Six polymorphismes connus ont été rencontrés, mais aucune mutation dommageable n'a été détectée. Nous ne pouvons toutefois pas exclure une délétion partielle ou totale du gène indétectable par le séquençage direct. Il se pourrait aussi que des mutations dans ce gène soient extrêmement rares et dès lors absentes dans la série testée, ou soient trop dommageables et incompatibles avec la vie. La deuxième partie du mémoire s'est focalisée sur l'impact de 11va riants trouvées dans HGF. Des vecteurs d'expression pour six mutants ainsi que le wild-type HGF humain ont été générés. Nous avons dans un premier temps transfecté des cellules COS-7 et vérifié l'expression, la stabilité et la sécrétion des mutants. La plupart des vecteurs mutants semblent induire une expression de HGF dans les lysats cellulaire quasi-identique au WT. Néanmoins, la majorité des mutants sont moins sécrétée dans le surnageant comparé au WT. Sachant que le ligand agit de manière dose-dépendante, cette faible différence de sécrétion pourrait influencer in vivo le degré de réponse des cellules exprimant le récepteur c-MET. La capacité des mutants à se lier au récepteur c-MET et à activer de la voie de signalisation en aval de celui-ci sont en cours d'investigation.La troisième partie de ce mémoire était consacrée à l'étude de 11changements identifiés dans les gènes 1et TSC2. Dans la littérature, les changements rencontrés dans ces deux gènes sont principalement à l’origine de la sclérose tubéreuse de Bourneville qui, dans certains cas, peut être associée à un lymphœdème. Afin d'étudier l'impact de ces changements, une collaboration a été mise en place avec le département de génétique du centre médical Erasmus à Rotterdam, spécialisé dans l'étude fonctionnelle des variants de TSC1 et TSC2. Nous avons effectué la mutagenèse dirigée pour ces changements. 7 mutants ont déjà été envoyés à Rotterdam et l'étude fonctionnelle de 6 mutants TSC2 a été réalisée. L’activité de TORC1 a été estimée dans des cellules HEK 293T transfectées, en calculant le ratio entre S6 kinase phosphorylée et S6 kinase totale, mesurées par immunoblotting. Nous n'avons pas vu d'effet sur cette voie canonique. L'interaction avec d'autres partenaires devra donc être explorée plus en détail.

Lymphedema --- Genes